ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования служили надпочечники и гипофизы новорожденных поросят (300 штук), доставляемых с Агрокомплекса "Слобожанский" Харьковской области, Чугуевского района, с. Граково, а также самцы белых беспородных крыс весом 150-170 г (210 штук).
2.1. Органное культивирование надпочечников и получение экстракта гипофиза из тканей новорожденных поросят
Новорожденных поросят после предварительного легкого наркоза эфиром забивали гильотинированием. Экстирпацию эндокринных органов осуществляли с соблюдением cтрогих правил асептики и антисептики.
Для получения экстрактов гипофизов брали навески по 2 г, ткань измельчали на микроизмельчителе РТ-2 и помещали в колбы на 250 мл, в которые добавляли 100 мл экстрагирующей жидкости (70 % этиловый спирт) и настаивали 20-40 мин. Гомогенат фильтровали. Из фильтрата отбирали аликвоты, которые добавлялись к исследуемым образцам [63, 103]. В экстракте измеряли белок по Бредфорду [85], по которому экстракт нормировался.
Органное культивирование осуществляли по стандартной методике [67]. Надпочечники сразу после выделения помещали в охлажденный стерильный физиологический раствор, в котором производили измельчение адренокортикальной ткани на фрагменты размером 0,5-1,0 мм, отмывали от крови средой 199 и в этой же среде оставляли при 4?С на 12-14 часов. Соотношение ткани и среды составляло 1:6 по весу. По истечению указанного срока производили замену питательной среды и помещали в термостат при 37?С. Замену питательной среды осуществляли в одно и то же время каждые сутки. Питательная среда готовилась на основе среды 199 с добавлением 10 % инактивированной эмбриональной сыворотки теленка и антибиотиков (пенициллин - 100 ед/мл и канамицин - 150 ед/мл). Культивирование проводили в течение 5-ти суток. Замену среды культивирования осуществляли через 24 часа.
В экспериментах по изучению влияния экстракта гипофиза на нативную культуру, экстракт гипофиза добавляли на 2, 3, 4 и 5 сутки культивирования на 24 часа из расчета 10 мкл на 1 мл среды и 1 г ткани. Содержание белка по Бредфорду в экстракте гипофиза составляло 0.5 мкг/мл. После каждых суток культивирования в среде измеряли количество белка, уровень собственной, а в отдельных случаях - стимулируемой секреции глюкокортикоидов. После криоконсервирования измеряли 11-ОКС в среде криоконсервирования и уровень базальной и стимулируемой секреции после часа инкубации в среде и в гомогенатах культуры.
2.2. Биохимические характеристики органной культуры надпочечников новорожденных поросят
В анализируемых образцах проводили измерение содержания белка в среде культивирования и гомогенатах культуры [10, 12, 63, 65], уровень собственной (базальной), а в отдельных случаях стимулируемой секреции глюкокортикоидов, а также в ряде экспериментов уровень утилизации различных фракций холестерина из питательной среды.
Определение уровня гормонов осуществляли флуориметрическим методом [94, 211] в нашей модификации, которая подробно изложена в главе 3.1 собственных исследований. Экстракцию гормонов осуществляли по схеме, представленной на рис. 2.1. Интенсивность флуоресценции измеряли на флуориметре Hitachi-MPF-2A при длине волны возбуждения 470 нм и длине волны испускания 525 нм. В качестве стандарта использовали кортизол и кортикостерон. При определении стимулируемой секреции гормонов использовали 10 % экстракты гипофизов или синтетический аналог АКТГ - синактен в концентрации 0,2 ЕД/мл. В ряде случаев использовали ингибитор стимулируемой секреции - CdCl2 в концентрации 10-2 М.
Все расчеты по содержанию гормонов производились на белок, который определяли по методу Бредфорда [85], или массу ткани.
Холестерин суммарный, свободный и связанный определяли спектрофотометрическим дигитониновым методом [48].
2.3. Гистологические исследования
Гистологическому анализу подвергалась нативная 5-и дневная, криоконсервированная, рекультивированная органная культура надпочечников новорожденных поросят, ксенотрансплантаты культуры после 30 и 45-и суток наблюдения, надпочечники новорожденных поросят и ложнооперированных крыс (с ксенотрансплантацией и без нее).
Материал для гистологического исследования фиксировали в 10% нейтральном формалине, по стандартной методике заливали в парафин [97]. Приготовленные на микротоме срезы 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозиноми, исследовали под световым микроскопом при увеличении 10?40 и 10?90 [68, 97, 136]. Микрофотосъемка осуществлялась с помощью микрофотонасадки МФНЭ-1У4.2 [68].
2.4. Криоконсервирование и анализ материала после отогрева
Замораживание культуры адренокортикальной ткани новорожденных поросят осуществляли с 5% димексидом по методу, разработанному в отделе криобиохимии и фармакологии нейрогуморальных систем [17]. Материал хранился в низкотемпературном банке разные сроки, максимальный - 1 год. Отогрев материала осуществлялся на водяной бане при 40?С. Криопротектор удаляли путем 4-5-и кратного отмывания средой 199.
Для определения базальной и стимулированной секреции, а также для модификации гормональной секреции культуру помещали в среду 199 на баню 37?С и инкубировали 1 ч (30 мин) со стимуляторами, ингибиторами или без добавления модификаторов в зависимости от цели эксперимента.
Рекультивировали отмытую после отогрева органную культуру надпочечников новорожденных поросят 1-3 суток в среде культивирования, описанной для нативной культуры.
2.5. Проведение адреналэктомий и трансплантаций криоконсервированной органной культуры надпочечников новорожденных поросят
Адреналэктомию крысам осуществляли по методике [12, 61], согласно которой операцию осуществляли под тиопенталовым наркозом из расчета 1 мл раствора с концентрацией 4.5 мг/мл на 100 г массы тела животного. Животное фиксировали на операционном столике спиной вверх, удаляли шерсть на участке спины ниже окончания ребер, протирали кожу спиртом и смазывали йодом. Посередине спины делали продольный р
- Київ+380960830922