РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
Исследования проводили на эритроцитах крови взрослых здоровых доноров и людей с
эндокринной патологией (гипо- и гипертиреоз), которую получали на Харьковской
областной станции переливания крови и в клинике при Институте проблем
эндокринной патологии им. В.Я.Данилевского АМНУ, а также на эритроцитах
пуповинной крови человека, которую получали описанным в [118] методом в
родильных отделениях харьковских клиник. В качестве консерванта во всех случаях
использовали раствор “Глюгицир”.
В экспериментах по определению осмотической хрупкости эритроцитов использовали
водные растворы хлорида натрия в концентрациях от 0,87% до 0,2% (т.е. от 0,15
до 0,05 Моль/л) с шагом 0,1%. При исследовании влияния гипертонии на эритроциты
использовали гипертонические водные растворы хлорида натрия с концентрацией
0,4М, 0,8М, 1,2М и 2М.
Для заполнения калиевого электрода использовали 0,1М водный раствор хлорида
калия. Для калибровки калиевого электрода готовили ряд растворов хлорида калия
(1-20 мМ) на 0,15 М хлориде натрия (все соли марки ХЧ).
Для изготовления высокоспецифичного калиевого электрода использовали
валиномицин фирмы Sigma. В качестве растворителя валиномицина использовали
дибутилфталат. Для изготовления ионселективной мембраны в качестве матрицы
использовали поливинилхлорид, который растворяли в циклогексаноне [119].
Для направленного изменения формы эритроцитов использовали хлорпромазин
(2-Chloro-10[3-dimetylaminopropyl]phenothiazine)hydrochloride) фирмы Sigma в
конечной концентрации 0,125-1,0 мМ. Раствор хлорпромазина с начальной
концентрацией 10 мМ готовили на физиологическом растворе.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Теоретические и экспериментальные основы использования метода
малоуглового светорассеяния. Основные экспериментальные результаты были
получены методом малоуглового рассеяния света суспензией эритроцитов [15,120].
Принцип регистрации рассеянного клетками под разными углами света довольно
часто используется для изучения клеточных суспензий [121]. Теоретический анализ
процессов поглощения и рассеивания электромагнитных волн малыми частицами
представлен в работах [122,123]. Рассеяние света биологическими суспензиями
определяется неоднородностями, каковыми являются взвешенные в жидкости клетки и
макромолекулы. Анализ полученных при этом результатов облегчается, если
взаимные расстояния в три раза превышают радиус рассеивающих частиц, что
является достаточным условием для того, чтобы считать их независимыми
рассеивателями. Другим необходимым условием, которое значительно упрощает
анализ и интерпретацию результатов измерений методом светорассеяния, является
возможность пренебрежения многократным рассеиванием. Прямая пропорциональность
между интенсивностью рассеивания и количеством частиц имеет место лишь при
условии, если падающее на частицу излучение не зависит от ее положения в слое,
что выполняется, если оптическая толщина изучаемого объекта мала.
Нами исследована зависимость интенсивности рассеяния света вперед под углом 9о
к направлению падающего пучка суспензией эритроцитов от количества в ней клеток
в используемой нами установке. На рис. 2.1. приведена калибровочная кривая, из
которой видно, что при добавлении к 3 мл физиологического раствора (объем
измерительной ячейки) более 0,015 мл крови интенсивность светорассеяния не
увеличивается. Очевидно, при этом количество клеток в суспензии становится
достаточно большим для возникновения эффекта многократного рассеяния.
Регистрацию интенсивности светорассеяния суспензией эритроцитов проводили в
диапазоне, соответствующем линейному участку калибровочной кривой.
Рис. 2.1. Интенсивность рассеянного света в зависимости от количества крови в 3
мл физиологического раствора
Из теоретических соображений следует, что измерения по принципу светорассеяния
является наиболее эффективным в случае, когда размер клеток примерно совпадает
с длиной световой волны. В нашем случае длина падающего на суспензию
эритроцитов света составляет ~1мкм, что исключает вклад поглощения в
интенсивность рассеянного света.
Индикатриса светорассеяния суспензией эритроцитов имеет два максимума при малых
углах (3о и 9о). Для измерения был выбран угол 9о, поскольку измерение в первом
лепестке (под углом 3о) приводит к существенным экспериментальным трудностям в
связи со сложностью разделения падающего и рассеянного света. При больших углах
интенсивность светорассеяния уменьшается, что понижает чувствительность прибора
к регистрируем ому параметру.
2.2.2. Устройство для измерения малоуглового светорассеяния клеточной
суспензией. Для измерения интенсивности рассеянного суспензией эритроцитов
света под углом 9о по направлению к падающему лучу, мы использовали
разработанный в отделе НТК и изготовленный научно-производственной фирмой
“Криокон” (г. Харьков) прибор, в состав которого входят: кюветная камера с
системой первичной обработки сигнала, устройство для поддержания температуры
кюветной камеры на заданном уровне, система регистрации результатов измерений.
Структурная схема прибора представлена на рис. 2.2. Объем фотометрической
кюветы составляет 3 мл. Устройство содержит коллимированный источник света
(арсенидгалиевый диод типа АЛ107Б) с диапазоном спектральной характеристики от
950 нм до 1100 нм и фотоприемник (фотодиод ФК-25К с интегральной
чувствительностью 8Ч10-3 мА/лк), установленный под углом 9о к направлению
падающего луча. Суммарная мощность ИК-излучения при исследовании образца не
превышает 2,5 Вт.
Выносной кюветный блок оборудован системами поддержки темпера
- Київ+380960830922