РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Подготовка биологического материала и условия проведения эксперимента
Для работы были использованы фрагменты ЭПЧ (8-11 недель гестации), полученные
после планового прерывания беременности по социальным показаниям при наличии
информированного письменного согласия донора на использование этого
биоматериала в исследовательских целях. В работе был исследован биоматериал от
64 эмбрионов. Фрагменты ЭПЧ транспортировались на льду в стерильных флаконах в
2 мл сахарозо-солевого раствора (ССР), разработанного для гипотермического
хранения [145] и криоконсервирования гепатоцитов [127]. ССР содержал 280 мМ
сахарозы; 5 мМ КСl; 5 мМ Na2HPO4; 1,5mM KH2PO4; 0.8 mM MgSO4 x 7H2O; 1,0 mM
CaCl2 (pH 7.2); 100 ед/мл канамицина.
В стерильных условиях фрагменты ЭПЧ тщательно промывали в свежей порции ССР,
затем осуществляли их дезагрегацию и выделение изолированных клеток. Первичные
суспензии клеток ЭПЧ получали неферментативным - вибрационным способом [27],
ферментативным методом - трипсинизацией [12]. Затем суспензии пропускали через
фильтры систем для переливания кровезаменителей.
Для выполнения исследований по криоконсервированию использовали криопротектор
ДМСО (Макрохим), который подвергали очистке по методу [3]. ДМСО "ч.д.а."
предварительно адсорбировали активированным углем в течение 24 часов,
фильтровали и подвергали двойной вакуумной перегонке при пониженном давлении
266,6 Па и температуре кипения 48–50 оС. Качество очистки проверяли
спектрофотометрически по показателю поглощения при длине волны 275 нм,
коэффициент преломления определяли на рефрактометре "УРЛ - М1" при 20 оС. Затем
очищенный ДМСО разливали в стерильные завальцованные флаконы по 10 мл и хранили
при температуре -80 оС. В экспериментах по криоконсервированию клеток ЭПЧ
использовали ДМСО с коэффициентом преломления ND20=1,4783 и коэффициентом
экстинции E275=0,17 ± 0,05.
Перед использованием в эксперименте криозащитную среду готовили ex tempora на
основе ССР или среды культивирования c конечной концентрацией ДМСО 0,7 М или
1,4 М в зависимости от задачи исследования. Охлажденную криозащитную среду
добавляли, медленно прикапывая равный объем к 0,5–1,0 мл клеточной суспензии.
Длительность пребывания клеток ЭПЧ в криозащитной среде до начала замораживания
составляла около 30 мин.
Криоконсервирование суспензий клеток ЭПЧ проводили в криоконтейнерах фирмы
“Nunc” (США) по режимам двух и трехэтапного замораживания (табл. 2.1).
Программное замораживание осуществляли на замораживателе ЗП 10 (СКТБ ИПКиК НАН
Украины).
Хранение криоконсервированных клеток осуществляли при – 196 оС в условиях
низкотемпературного банка ИПКиК НАНУ от 1 до 16 недель.
Отогрев замороженных образцов проводили в течение 40-50 с на водяной бане при
37 оС [170].
Удаление криопротектора ДМСО из криозащитной среды осуществляли путем
медленного капельного добавления раствора отмывания (РО), при этом
размороженные суспензии разводили в 5 – 10 раз. Затем пробы центрифугировали
(200g) в течение 10 мин, удаляли надосадочную жидкость и к осадку добавляли 1
мл РО. В качестве РО использовали ССР, раствор Хенкса или среду культивирования
в зависимости от условий эксперимента, которые будут подробно рассмотрены в
соответствующих главах собственных исследований.
Таблица 2.1
Режимы замораживания клеток ЭПЧ.
№/№
Режимы
первый етап – погружение криопробирок в спиртовую баню при -25оС и экспозиция в
течение 20 мин, второй этап – перенос в жидкий азот
II
первый етап – размещение криопробирок в криоконтейнере Cryo 1°°С Freesing
Container (Nalgene) с изопропиловым спиртом и выдерживание при -80 оС в течение
4-х ч; второй этап – перенос в жидкий азот
III
первый этап – охлаждение со скоростью 1 оС/мин до -40 оС, второй этап
–10 оС/мин до -80 оС; третий – перенос в жидкий азот
IV
первый этап – охлаждение со скоростью 1 оС/мин до -20 оС, второй этап – 10о
С/мин до-60 оС; третий – перенос в жидкий азот
первый этап – охлаждение со скоростью 1 оС/мин до -20 оС, второй этап –
5оС/мин до -60 оС; третий – перенос в жидкий азот
VI
первый этап – охлаждение (с использованием инициации кристаллообразования) со
скоростью 1 оС/мин до - 20 оС/мин, второй этап – 5 оС/мин до -60 оС; третий –
перенос в жидкий азот.
2.2. Методы исследования
Для предварительной характеристики состояния клеток ЭПЧ использовали
экспресс-методы оценки жизнеспособности клеток ЭПЧ в составе первичной
суспензии на различных этапах исследования. Для этих целей использовали методы
прижизненного окрашивания с использованием ТС, ЭБ и ФДА.
Окрашивание красителем ТС [144]. Аликвоту клеточной суспензии смешивали с
0,4%-м раствором красителя (1:1) и помещали в камеру Горяева для подсчета
количества окрашенных (поврежденных) и неокрашенных (условно жизнеспособных)
клеток стандартным методом [30]. Анализ полученных результатов проводили по
формулам [45]:
A=
x100 %,
B=
x100 %,
C=
x100 %,
a
где A – выход общего количества клеток;
B – выход жизнеспособных клеток,
С – жизнеспособность;
а – общее количество клеток после воздействия;
b – общее количество клеток до воздействия;
c – количество жизнеспособных клеток после воздействия.
Комбинированное окрашивание с помощью ЭБ и ФДА [67]:
1) раствор ЭБ готовили в концентрации 200 мкг в 1мл раствора Хенкса без
фенолового красного (раствор№ 1);
2) раствор ФДА готовили в концентрации 5 мг в 1 мл ацетона (раствор № 2)
Приготовленные растворы (№ 1 и № 2) хранили в морозильной камере.
Рабочую смесь получали ex tempora: к 4,9 мл раствора Хенкса без фенолового
красного (pH 7,4) добавляли 100 мкл раствора №1 и 2
- Київ+380960830922