РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проводились в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН
Украины на базе 5-го специализированного клинического родильного дома и на базе
Центра репродукции человека «Имплант» (г. Харьков).
Объекты исследования
В качестве объектов исследования использовали спермии, яйцеклетки и эмбрионы
человека.
Спермии получали из эякулятов мужчин бесплодных супружеских пар, проходивших
лечение по программе ЭКО.
Яйцеклетки получали путем пункции яичников женщин, лечившихся по поводу
бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения.
Эмбрионы получали по стандартным протоколам ЭКО после инсеминации ооцитов
спермой, хранившейся в условиях гипотермии.
Метод цитологического исследования эякулята
Эякулят получали у мужчин после 3-5-ти-дневной сексуальной абстиненции путем
мастурбации. Приемником спермы служила стерильная чашка Петри. Эякулят помещали
в термостат (при температуре 37°С) до полного разжижения. Объем эякулята
измеряли в мерной пробирке; pH определяли сразу же после получения эякулята.
Время разжижения оценивали с момента эякуляции до полного разжижения. Для
дальнейшего исследования отбирали эякуляты с растяжимостью не более 0,1-0,5
см.
После разжижения производили микроскопическую оценку эякулята, руководствуясь
рекомендациями ВОЗ [164] при увеличении x240; x480; x1200. Для определения
концентрации сперматозоидов использовали камеру Macler (Sefi Medical
Instruments, Haifa, Israel, 1980) - специальную камеру для подсчета
сперматозоидов, не требующую разведения спермы. При этом 0,01 мл
неразбавленного образца семени помещали на счетную область камеры и закрывали
покровным стеклом, имеющим на своей поверхности специальную сеточку из ста
квадратов. Число сперматозоидов, содержащихся в любых 10 малых квадратах,
представляло концентрацию сперматозоидов в миллионах/мл. Для составления
кинезисграммы определяли процентное содержание спермиев с быстрой прогрессивной
подвижностью (активноподвижные) и с медленной прогрессивной подвижностью
(подвижные). Кинезисграмму составляли на основании градации спермиев по
скорости движения в камере следующим образом:
группа "а" (с быстрым прогрессивным прямолинейным движением; активноподвижные)
– спермии, которым для преодоления расстояния по диагонали одного квадрата
требуется менее 4-х секунд;
группа "в" (с медленным прогрессивным движением; подвижные)- спермии,
преодолевающие путь по диагонали квадрата за 4-10 секунд;
группа "с" (без прогрессивного движения) – спермии, затрачивающие на указанный
путь 10-30 секунд.
Неподвижные гаметы по указанной классификации составляют группу "d".
Согласно классификации ВОЗ [164], нормоспермии соответствуют следующие
показатели спермограммы: объем: 2-6 мл; pH: 7,2- 8,0; разжижение: 20-40 минут;
концентрация: более 20 млн/мл; содержание спермиев группы “а”: более 25 %;
группы “в”: более 30 %; жизнеспособных: более 75 %; спермиев с нормальной
морфологией: более 30 %; лейкоцитов: не более 6 млн/мл; агглютинатов: не более
3-х в поле зрения.
При показателях спермограммы ниже этих уровней производили повторный анализ
спермы.
Для описания типов отклонений использовали классификацию согласно рекомендациям
ВОЗ [164]:
- Нормоспермия (смотри выше);
- Олигозооспермия - концентрация ниже 20 х 106 /мл;
- Астенозооспермия - менее 50 % с поступательным движением или менее 25 % с
быстрым линейным поступательным движением;
- Тератозооспермия - менее 30 % с нормальной морфологией;
- Олигоастенотератозооспермия - нарушение всех трех показателей;
- Азооспермия - нет сперматозоидов в эякуляте;
- Аспермия - нет эякулята.
В работе использовали эякуляты с нормозооспермией и астенозооспермией.
Методика выделения подвижной фракции спермиев из эякулята
При проведении программы экстракорпорального оплодотворения проводили выделение
из эякулята фракции спермиев с быстрым прогрессивным прямолинейным движением
(активноподвижные). Для этого использовали метод “всплывания” - swim up с
трехкратным центрифугированием [5]. Для выделения использовали среду Хенкса.
Одну часть спермы смешивали с 10 частями среды и центрифугировали 5 минут при
2000 об/мин. Затем удаляли надосадочную жидкость, осадок смешивали с 4-5 мл
среды, многократно пипетировали и повторно центрифугировали в том же режиме,
после чего удаляли надосадочную жидкость. На осадок спермиев осторожно
наслаивали среду Menezo B2 в объеме 0,5-0,7 мл, помещали в СО2-инкубатор с 5 %
СО2 и температурой 370С на 1 час, установив пробирку под углом 45°. Затем
надосадок отбирали в новую стерильную пробирку и центрифугировали третий раз со
скоростью 2000 об/мин 5 минут. После этого надосадочную жидкость осторожно
удаляли, на осадок наслаивали 0,3 мл среды Menezo B2 и помещали в инкубатор на
3 минуты. Затем с помощью камеры Makler определяли подвижность и концентрацию
сперматозоидов. Полученную суспензию гамет использовали в исследованиях.
Методики определения переживаемости спермиев
Переживаемость спермиев [29] определяли контролем жизнеспособности и
кинезисграммы через 1 час, 24 часа, 48 часов и 72 часа после выделения из
эякулята фракции спермиев с прогрессивным движением по вышеописанной методике с
использованием среды Menezo В-2 и той же фракции, прошедшей условия
гипотермии.
Определение жизнеспособности спермиев производили методом суправитальной
окраски, основанном на способности дегидрогеназы живых спермиев восстанавливать
молекулы эозина, т.е. обесцвечивать краситель [164]. На предметном стекле
смешивали 1 каплю активноподвижной фракции спермиев и 1 каплю 1,4 %-ного
эозина, готовили мазок, который высушивали при ком
- Київ+380960830922