РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования были выполнены на белых 5-6 мес. крысах-самцах массой 160-180 г (116 животных) и на половозрелых мышах-самцах линии СВА массой 19-22 г (120 животных), содержащихся в стандартных условиях вивария Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. Все манипуляции с животными выполнены согласно Международным принципам Европейской конвенции о защите позвоночных животных (Страсбург, 1985г.).
2.1. Индукция АИЗ у экспериментальных животных
Индукцию АА у крыс осуществляли субплантарным введением 0,2 мл полного адъюванта Фрейнда, содержащего 3 мг/мл Micobacterium tuberculosis, на 100 г массы животного по методу Пирсона [178]. ЭАЭ индуцировали введением в подушечки четырех лап крыс 0,4 мл гомогената аллогенной ткани спинного мозга, эмульгированной в полном адъюванте Фрейнда [40]. Контролем служила группа здоровых животных.
2.2. Методы оценки состояния лимфогемопоэтической системы экспериментальных животных в динамике развития АИЗ
На 7-е, 14-е, 21-е и 28-е сутки после иммунизации животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Для оценки иммунного и биохимического статуса организма экспериментальных животных использовали селезенку, печень и костный мозг.
Получение суспензии клеток селезенки
Селезенку, извлеченную из брюшной полости животного, отмывали в забуференном физиологическом растворе. Вес органа определяли на торсионных весах. После этого селезенку помещали в гомогенизатор Поттера и гомогенизировали на среде 199 с добавлением сыворотки и 2% раствора цитрата натрия. Полученный гомогенат пропускали через капроновый фильтр, после чего в камере Горяева подсчитывали количество ядросодержащих клеток селезенки [66].
Выделение мононуклеаров селезенки
Мононуклеары селезенки получали центрифугированием суспензии клеток в градиенте фиколл-верографина (d=1,077) [114]. Полученную после центрифугирования суспензию мононуклеаров отмывали и ресуспендировали в растворе Хенкса без фенолового красного.
Получение гомогената печени
1г ткани печени измельчали ножницами, отмывали от крови и гомогенизировали в 4 мл 100 мМ трис- HCl-буфера, pH 7,4. Полученный гомогенат фильтровали через капроновый фильтр.
Получение суспензии клеток костного мозга
Бедренные кости очищали скальпелем от мышечной и соединительной тканей, срезали ножницами эпифизы и вымывали клетки КМ из костномозгового канала средой 199 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2% цитрата натрия. Однородную суспензию клеток получали путем многократного пропускания через иглы уменьшающегося диаметра. Количество ядросодержащих клеток костного мозга подсчитывали в камере Горяева [66].
Иммунологические методы
Определение количества Т-хелперов и Т-супрессоров спленоцитов и клеток костного мозга экспериментальных животных
Содержание субпопуляционного состава Т-клеток в селезенке и КМ крыс определяли методом прямой мембранной иммунофлуоресценции [113]. С помощью ФИТЦ - меченых моноклональных антител (CALTAG, USA) оценивали экспрессию антигена на спленоцитах, выявляемого антителами к СD-4+ и СD-8+ кластерам; на клетках КМ - к СD-3+, СD-4+ и СD-8+ структурам.
Определение процентного содержания Т-клеток: исследуемую суспензию клеток вносили в центрифужные пробирки в объеме 50 мкл с концентрацией 3х106 клеток/мл. К данной суспензии добавляли по 5 мкл соответствующих моноклональных антител и инкубировали на льду при температуре +4°С в течении 50 минут. Затем клетки двукратно отмывали средой Хенкса и добавляли в каждую пробу по 50 мкл формалина. Подсчет содержания Т-клеток осуществляли с использованием люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ Р1 (ЛОМО). Иммунорегуляторный индекс (ИРИ) рассчитывали как отношение СD4+- к СD8+-клеткам.
Оценка спонтанной цитотоксичности мононуклеаров селезенки
Спонтанную цитотоксичность спленоцитов крыс определяли спектрофотометрическим методом [76]. Эритроциты получали из подкрыльцевой вены курицы. Концентрацию клеток доводили до 1х106 в мл на 1 пробу. Затем к клеткам-мишеням (эритроциты кур) добавляли клетки-эффекторы (мононуклеары селезенки) в соотношении 1:1. Через 18 часов инкубации при температуре 37°С пробы центрифугировали и определяли оптическую плотность надосадка на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 540 нм. Спонтанную цитотоксичность оценивали по оптической плотности гемоглобина, вышедшего из разрушенных эритроцитов в среду.
Индекс цитотоксичности определяли по формуле:
Опыт - спонтанный лизис х 100%,
Max лизис - спонтанный лизис
где:
опыт - оптическая плотность пробы, содержащей клетки эффекторы и мишени;
спонтанный лизис - оптическая плотность пробы, содержащей мишени в бесцветной среде;
максимальный лизис - оптическая плотность пробы, содержащая мишени и дистиллированную воду.
Определение циркулирующих иммунных комплексов
В сыворотке крови проводилось определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). В основу метода положена способность раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) осаждать из сыворотки агрегированные иммунные глобулины и иммунные комплексы [99]. Различные концентрации ПЭГ (2,5; 3,5; 7; 10%) вызывают преципитацию различных по молекулярной массе и размерам иммунных комплексов. Низкие концентрации ПЭГ осаждают комплексы крупных размеров; высокие концентрации вызывают преципитацию низкомолекулярных соединений. Для проведения определения готовили 10% раствор ПЭГ на 0,1М боратном буфере (рН 8,4). Исследуемую сыворотку разливали по 200 мкл в пробирки №1 и №2. В первую пробирку (С3) добавляли исходный раствор ПЭГ до получения 3% концентрации ПЭГ, во вторую (С4) - до получения 4% раствора ПЭГ. Содержимое обеих пробирок тщательно перемешивали и инкубировали 18-20 часов при +4?С, после чего смесь центрифугировали 30 мин со скоростью 1500 об/мин. Затем супернатант удаляли, а к осадку, содержащему иммунные ко