РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Получение монослойной культуры ФПК человека ранних стадий органогенеза.
Объектом исследования служили культивированные ФПК человека ранних стадий органогенеза 3-12-го пассажей. Для получения культуры клеток в работе были использованы фрагменты тканей 17 эмбрионов человека 5-6 недель гестации, полученных после искусственного прерывания беременности с письменного согласия проинформированных доноров в соответствии с рекомендациями Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации по проведению биомедицинских исследований.
Фрагменты ткани доставлялись в лабораторию в специально разработанной для гипотермического хранения биологического материала сахарозно-солевой среде [145] в стерильных контейнерах на льду.
Для получения первичной культуры клеток использовали метод культивирования тканевых эксплантатов [146, 147]. Для частичной дезагрегации фрагментов ткани применяли модифицированный неферментативный метод [148]. Для этого биоматериал трижды промывали в чашке Петри физиологическим раствором, содержащим канамицин (100 ед/мл) и измельчали с помощью пинцета и препаровальной иглы. После этого фрагменты ткани помещали в стерильные пластиковые пробирки, добавляли 2,5 мл среды ?-МЕМ (Sigma, США) и подвергали вибрации с частотой 50-100 Гц с помощью специального устройства. Полученную суспензию, содержащую тканевые фрагменты и клетки, помещали в 25 см2 культуральный флакон (Nunc или Corning, США), дополняли 15% сыворотки крови эмбрионов крупного рогатого скота (ЭС, ООО "БиолоТ", Россия), 100 ед пенициллина, 100 мкг стрептомицина и культивировали при 37°С / 95% влажности в атмосфере с 5% СО2. Через 24-48 часов убирали неадгезивную фракцию клеток и неприкрепившиеся фрагменты ткани и вносили свежую культуральную среду. Смену среды производили два раза в неделю. По достижении культурой 60-70% конфлуента клетки снимали с субстрата. Для этого после удаления культуральной среды поверхность клеточного пласта споласкивали подогретым до 37 °С 0,02%-м раствором Версена (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, Россия) и заливали смесью раствора Версена с 0,25%-м раствором трипсина (ГУП ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, Россия) в соотношении 4:1. Клетки выдерживали 3-5 мин при 37 °С до полного открепления, а затем для нейтрализации действия трипсина добавляли культуральную среду, содержащую ЭС. Затем суспензию с открепившимися клетками переносили в центрифужные пробирки (Sarstedt, Германия) и ценрифугировали при 200g в течение 7 мин. Полученный осадок суспендировали в свежей культуральной среде и помещали в новые культуральные флаконы с коэффициентом рассева 1:2. После первого пересева клетки переводили в среду ?-МЕМ с 10% ЭС. Для дальнейших исследований использовали клетки 3-12 пассажей.
Для изучения морфологии культивированных клеток культуры фиксировали 70% этанолом и окрашивали азур-эозином [146]. Прижизненную микроскопию, а также анализ окрашенных препаратов культур клеток проводили с использованием инвертированного микроскопа CETI (Голландия), снабженного цифровой камерой Nicon CoolPix 4500.
2.2. Определение концентрации клеточной суспензии.
Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева согласно стандартным методикам [146]. Концентрацию клеток в суспензии рассчитывали по формуле:
4,
где С - количество клеток в 1 мл клеточной суспензии;
N - количество клеток в 25 квадратах камеры Горяева;
n - разведение.
2.3. Определение сохранности клеток по окрашиванию трипановым синим.
Сохранность клеток определяли по окрашиванию витальным красителем трипановым синим [149, 150]. Для этого 10 мкл суспензии клеток смешивали с 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего (Sigma, США). Подсчет клеток проводили через 1-5 мин после смешивания в камере Горяева. Сохранность клеток определяли как процентное соотношение клеток, устойчивых к окрашиванию красителем (А), к общему количеству подсчитанных клеток (Б) по следующей формуле:
2.4. Проведение иммунофенотипического анализа культивированных ФПК человека ранних стадий органогенеза методом проточной цитофлуориметрии.
Иммунофенотипический анализ ФПК проводили с использованием моноклональных антител CD29-РЕ, CD45-PE, CD105-FITC (Serotec Ltd, США), CD34 Class II-FITC, CD 38-RPE (DAKO, Голландия), CD44-FITC, CD73-PE (BD Biosciences). Суспензию клеток 4-12 пассажей до или после криоконсервирования окрашивали моноклональными антителами согласно инструкции производителя, дважды отмывали центрифугированием при 200g в течение 10 мин в солевой среде Дюльбекко (Sigma, США). Параллельно с контрольной аликвотой клеток проводили все операции, за исключением окрашивания моноклональными антителами. Полученные образцы анализировали на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (BD Biosciences, США).
Результаты проточной цитометрии анализировали с использованием программы WinMDI v 2.8 и представляли в виде точечных графиков. Каждая точка на графике соответствовала клетке, координаты точки - параметрам интенсивности свечения клеток, меченных моноклональными антителами.
Для корректного определения процентного содержания клеток, экспрессирующих исследуемые маркеры, клетки с аномальным свечением флуоресцеин изотиоцианата и фикоэритрина (определялось при анализе неокрашенного контроля) не принимались в рассмотрение.
2.5. Оценка дифференцировочного потенциала культивированных ФПК человека ранних стадий органогенеза в остеогенном и адипогенном направлениях.
Суспензию ФПК человека ранних стадий органогенеза 3-12 пассажей до или после криоконсервирования разводили средой ?-МЕМ с 10% ЭС до концентрации 20?103 клеток/мл. После чего вносили в 24-луночный культуральный планшет по 0,5 мл суспензии в лунку и помещали в условия культивирования. Через 24 ч после посева среду в лунках заменяли на свежую ?-МЕМ с 10% ЭС (контрольные лунки) или остеогенную, или адипогенную среду. Затем смену среды на соответственную производили через 3-4 суток. Клетки в контрольных лунках для учета спонтанной дифференцировки культивир