РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Експериментальні тварини
У дослідженнях, присвячених вивченню механізмів різних форм підвищення збудливості мозку, а також патогенезу епілептичного синдрому, найчастіше oб'єктoм дослідження є головний мозок щура [Шандра А.А. и соавт., 1999; Окуджава В.М. и соавт., 1999; Pocernich C.B. et al., 2000; Loscher W. et al., 1996]. Виходячи з методичних переваг даної моделі, а також ґрунтуючись на цілях і задачах дослідження, в теперішній роботі експериментальними тваринами були обрані статевозрілі білі щури обох статей- лінії Віcтар. Досліди на них проводилися відповідно до вимог та правил, висловлених в "Міжнародних рекомендаціях по проведенню медико-біологічних досліджень з експериментальними тваринами", запропонованих Радою міжнародних медичних організацій в 1985 р., розробленому на їх основі додатку до Наказу Міністерства охорони здоров'я СРСР N 755 від 12.08.1977 р. "Про заходи по подальшому вдосконаленню форм роботи з використанням експериментальних тварин", а також відповідно до зауважень, висловлених в "Листі комісії по проблемі етики відношення до тварин" (Успіхи фізіологічних наук. - 1993- Т.24,N4.- С.108).
Дослідження проводилися за умов гострого і хронічного експериментів на 327 білих щурах-самцях лінії Віcтар, масою від 180 до 320 г. Тварин містили в боксах з природною зміною світла і темноти, з вільним доступом до води і їжі. З метою приручення, щурів перед початком експерименту тримали в руках по 2-3 хв протягом 5 днів, що полегшувало подальші експериментальні дослідження з експериментальними тваринами [Бyреш Я. та ін., 1991].
2.1. Моделі епілептичної активності
2.1.1. Осередки епілептичної активності. Одиночні епілептичні осередки створювалися у щурів за умов штучної вентиляції легень і м'язової релаксації за допомогою розчину d-тyбoкyрарина (0.2 мг/кг). Підготовчі операції (трахеотомія, трепанація черепа, імплантація електродів) у щурів проводили під ефірним рауш-наркозом. Краї операційних ран ін'єктувалися 0,5 % розчином новокаїну. Місцеве знеболення повторювалося кожні 1,5-2,0 год. Штучне дихання проводилося за допомогою апарату фірми G.F. Palmer Ltd (Англія). Осередки епілептичної активності викликали в різних відділах фронтальних ділянок кори мозку щурів аплікацією на поверхню головного мозку тварин шматочків фільтрувального паперу (2 мм х 2 мм), які були змочені в свіжовиготовленому розчині натрієвої солі бензилпеніциліну з розрахунку (16.000 МО/мл). Вогнища ЕпА формували введенням у вентральні відділи гіпокампу (AP= -4,3; L= 4,5; H= 8,0) [Paxinos G., & Watson С., 1982] каїнової кислоти з розрахунку 1,0 мкг за умов вільної поведінки тварин, через заздалегідь імплантовану канюлю.
Визначали латентний період появи епілептичних розрядів у осередках та тривалість їх існування. Для характеристики осередкової епілептичної активності використовували показники амплітуди розрядів (мВ), а також частоту потенціалів за одну хвилину спостереження. Також застосовували показник потужності осередків, який обчислювали шляхом множення середньої амплітуди розрядів на число потенціалів за одну хвилину спостереження [Шандра А.А. и соавт., 1999].
2.2. Електроподразнювальний кіндлінг
Для електроподразнювальних дій використовували вентрально-базальні відділи мигдалини, структури якої відрізняються підвищеною чутливістю до дії епілептогенних подразників [MсNamara J.O., 1988; Raсine, R.J.,1972].
Щурам під нембyталовим наркозом (35 мг/кг) імплантували біполярні електроди (діаметр 0,10-0,15 мм; міжелектродна відстань 0,20-0,30 мм), виготовлені з константанового, ізольованого, окрім кінчика, дроту у вентро- базальні відділи лівої мигдалини по координатах стереотаксичного атласу головного мозку щура G.Paxiпоs & C.Watsоn (1982) (AP= -2,8; L= 4,5; H= 8,2), відповідно до описаної в літературі методики [М.Я.Волошин, 1987; А.Д.Ноздрачев і ін., 1987; Я.Бyреш і ін., 1991] за допомогою стереотаксичного апарату типу СЕЖ-5, а також апарату типу Ковача (Угорщина). Операція імплантації електродів полягала в наступному. Тваринам, фіксованим в умовах ефірного раyш-наркозу в стереотаксичному апараті, здійснювали розріз шкіри і м'яких тканин, видалення окістя і трепанацію черепа за допомогою стоматологічної бір-машини БЕПБ-06М. Перед фіксацією електродів поверхня черепа оброблялася 5.0 % розчином перекису водню. Електроди кріпили до черепа зубним цементом "Palavit-55" (Німеччина). З метою запобігання розвитку інфекції твариною протягом післяопераційного періоду (7-10 днів) внутрішньом'язово вводили розчин натрієвої солі бензилпеніциліну (40000 МО/кг) або біциллін-3 в дозі 50000 МО/кг.
Електричні подразнення (частота 60 Гц, сила струму 20-40 мкА, тривалість прямокутного імпульсу 0.25 с, тривалість роздратування - 1с) починали здійснювати через 7-10 діб після імплантації електродів за умов вільної поведінки тварин. Інтенсивність подразнення підбирали індивідуально для кожної тварини, починаючи з 20 мкА і збільшуючи силу струму на 20 % від початкової величини до тих пір, поки в зоні ЕП не починав реєструватися післярозряд тривалістю більше 5 с.
Сила струму, яка викликала післярозряд вважалася підпороговою. У подальшому ЕП повторювали щоденно, двічі на день, підібраної інтенсивності подразнення. Тварини, яким електричні подразнення наносилася силою струму понад 40 мкА, виключалися з досліду. За аналогічних умов у тварин контрольної групи імплантовані біполярні електроди поєднували з електричним подразником без подачі електричного струму. Судомні прояви оцінювали за шкалою, запропонованою Шандрою О.А. та співавт. (1999): 0 балів - відсутність судомної реакції; 1 бал - міоклонічне здригання голови або тулуба; 2 бали - клонічні судоми м'язів тулуба і кінцівок; 3 бали - клонуси м'язів передніх кінцівок, підйом тварин на задні кінцівки ("поза кенгуру"); 4 бали - генералізовані тоніко-клонічні судоми з падінням тварин на бік.
2.3. Гострий гене