РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Моделювання гломерулонефриту на тваринах
Експериментальна частина роботи виконана на 59 самцях білих щурів масою 190 - 220 г. Усі тварини були поділені на 4 групи.
У 1-у, контрольну, групу ввійшли 16 тварин. 2-а (основна) група включала також 16 тварин, на яких моделювали ГН. У 3-й групі (15 особин) після створення моделі експериментального ГН проводили лікування основними засобами патогенетичної терапії захворювання: глюкокортикоїдним гормоном дексаметазоном та імунодепресантом цитотоксичної дії циклофосфамідом. У 4-й групі 12 щурам з експериментальним ГН, крім дексаметазону і циклофосфаміду, вводили препарат для корекції порушень ЕФ - еналаприлат (0,125 % розчин еналаприлу), який є ІАПФ.
ГН моделювали шляхом триразового введення щурам у корінь хвоста повного ад'юванту Фрейнда з нирковим антигеном (розчин ліофілізованого водно-сольового екстракту кори нирок) і розчином селезінкової дезоксирибонуклеїнової кислоти великої рогатої худоби (Олайна, Латвія). Доза першого введення ад'юванту Фрейнда складала 5 мг/кг маси тварини. Дозу другого введення (на 15-у добу від початку експерименту) знижували в 2 рази порівняно з першим, а дозу третьго (на 25 добу від початку експерименту) - ще вдвічі порівняно з другим.
Додатково тварин піддавали іонізуючому опроміненню в дозі 0,48 Гр через 14 днів після першого і через 9 днів після другого введення ад'юванту. Моделювання ГН здійснювали протягом одного місяця.
Тваринам, які входили у 3-ю і 4-у групи експериментів, після закінчення моделювання ГН протягом наступного місяця, щодня внутрішньом'язово вводили дексаметазон у дозі 1 мг/кг і циклофосфамід - 5 мг/кг. У тварин 4-ї групи терапію доповнювали еналаприлатом, який вводили по 0,1 мл внутрішньом'язово щодня.
Як контрольні використовувалися тварини, на котрих виконували всі маніпуляції, аналогічні таким у дослідних групах, при цьому замість ад'юванту Фрейнда і лікарських препаратів уводили відповідні об'єми 0,9 % розчину натрію хлориду. Тварин контрольної групи впливу іонізуючого опромінення не піддавали.
Усіх щурів виводили з експерименту через 2 місяці від його початку в умовах ефірного наркозу шляхом декапітації. Утримання тварин і всі маніпуляції над ними здійснювали відповідно до загальних вимог і положень Європейської Конвенції по захисту хребетних тварин, що використовуються для дослідних та інших наукових цілей (Страсбург, 1986), схвалених Першим національним конгресом по біоэтиці (Київ, 2001) і Закону України №3447-IV від 21.02.2006 р. "Про захист тварин від жорстокого поводження", та узгодженням із комісією з питань біоетики Донецького державного медичного університету ім.М.Горького.
2.2. Характеристика обстежених хворих
Під спостереженням перебували 49 хворих на ГН (25 чоловіків і 24 жінки) віком від 16 років до 67 років (у середньому 35,9±2,4 років). Тривалість маніфестації захворювання складала від 2 місяців до 14 років (у середньому 2,9±0,4 років). У 14 пацієнтів (28,6 %) діагностовано нефротичний синдром, у 17 пацієнтів (34,7 %) констатовано систолічну артеріальну гіпертензію (>140 мм рт.ст.), у 16 пацієнтів (32,7 %) - діастолічну артеріальну гіпертензію (>90 мм рт.ст.). Рівень середнього артеріального тиску склав 114,8±3,2 мм рт.ст., параметри периферійного судинного опору - 2817,1±101,8 дин.с.см-5. Хворі перебували в I-III стадіях хронічного захворювання нирок (величини клубочкової фільтрації склали від 33 мл/хв до 129 мл/хв, у середньому - 117,5±7,5 мл/хв). Показники швидкості клубочкової фільтрації в чоловіків виявилися на 28,6 % меншими, ніж у жінок (S=2,18; p=0,035).
Усім хворим було виконано пункційну нефробіопсію. У 37 випадках (75,5 %) установлений хронічний МПГН, в інших 12 випадках (24,5 %) -МКГН. У 38 хворих (77,6 %) зафіксовано ТІК ниркової патології. Чоловіки і жінки вірогідно не відрізнялися між собою за клініко-морфологічними варіантами перебігу ГН (?2 складав 0,52-1,22, а вірогідність розходжень - 0,470-0,270).
Імунофлюоресцентне дослідження нефробіоптатів проведено 27 хворим (13 чоловікам і 14 жінкам) віком від 16 до 62 років (у середньому 31,4±2,6 років). У 77,8 % пацієнтів спостерігали МПГН, у 22,2 % - МКГН. Нефротичний синдром констатовано в 22,2 % спостережень, рівень середнього артеріального тиску склав 109,2±2,3 мм рт.ст., периферійного судинного опору - 2688,9±112,3 дин.с.см-5, креатинінемії - 108,7±8,6 мкмоль/л.
Як контроль обстежено 30 практично здорових людей (12 чоловіків і 18 жінок) віком від 18 років до 60 років.
2.3. Методи дослідження
Експериментальну частину роботи виконано на базах Центральної науково-дослідної лабораторії і кафедри мікробіології Донецького державного медичного університету ім. М.Горького, а клінічну - на базі Донецького обласного клінічного територіального медичного об'єднання за участю професора Ю.І. Ніколенка і чл.-кор. АМН України, професора О.В. Синяченка.
Нефробіопсію виконували на фоні атаралгезії (внутрішньовенне введення димедролу, сибазону і промедолу) під контролем ультразвукового дослідження нирки. Використовувалася методика "TrueCut" із застосуванням високошвидкісного пістолета "Biopty" (фірма "Bard", США).
Гістологічні зрізи забарвлювали гематоксиліном-еозином, і за Ван-Гізон, ставилася PAS-реакція. Крім того, проводили імунофлюоресцентний (визначення імуноглобулінових депозитів) метод дослідження тканин нирок.
Ураження окремих ниркових структур (клубочків, канальців, строми, судин) оцінювали в балах (від 0 до 3). При цьому підраховували середній показник ушкоджень (СПУ) за формулою:
СПУ = ( а+ 2b + 3c ) : ( a + b + c + d ) (2.1)
де а, b, c - кількість досліджень, відповідно, з 1, 2 і 3 балами;
d - кількість досліджень з відсутністю даної ознаки.
Креатинін в сироватці крові досліджували з використанням реактивів "LaChema" (Чехія). Рівень NO у сироватці крові оцінювали за кінцевими продуктами його метаболізму - нітритами (NO2), використавши методику із застосуванням реактив