РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика піддослідних тварин, перебіг експерименту
2.1.1. Піддослідні тварини. Дослідження проведені на 297 ювенільних самцях
безпородних білих щурів масою 60-80 г. Використання для експерименту
статевонезрілих самців обумовлено тим, що головний мозок тварин цієї статі,
особливо цього віку, більш чутливий до дії окисного стресу, ніж у самок [201],
а також тим, що у тварин такого віку (60 днів) зростає імовірність досягнення
впродовж невеликого проміжку часу (одного тижня) вірогідних фотоперіодичних
змін [202]. У той же час мозок на цей період розвитку вже є сформованим,
оскільки у щурів критичний період морфофункціонального дозрівання мозку
припадає на 14 день постнатального розвитку, диференціювання нервових клітин
мозку закінчується процесами мієлінізації приблизно на 21 день життя [203].
Крім того, біохімічні показники структур головного мозку щурів з 21 дня
постнатального розвитку відповідають показникам дорослої тварини [204].
Щурів утримували при кімнатній температурі, на стандартному харчовому раціоні
віварію, з вільним доступом до води. Робота з лабораторними тваринами
проводилась з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про
захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших
цілей (Страсбург, 1985) [205].
За десять днів до початку моделювання фотоперіодичних змін у щурів, що відразу
після цього підлягали дослідженню впливу кисневої недостатності, визначали їх
стійкість до гострої гіпобаричної гіпоксії і в подальшому використовували лише
середньостійких тварин, в яких час життя на “висоті”, що еквівалентна 12000 м,
лежав у межах 30% від середньоарифметичного значення часу життя досліджуваних
тварин [206].
2.1.2. Моделювання фотоперіодичних змін. Фотоперіодичні зміни моделювалися
впродовж одного тижня за допомогою різних режимів освітлення: 1) природна зміна
світлової і темнової фаз доби – звичайне освітлення; 2) постійне впродовж доби
світло; 3) постійна цілодобова темрява. Дослідження виконані в однаковий період
року (осінньо-зимовий) з метою уникнення розбіжностей у вмісті досліджуваних
показників. Режими освітлення створювалися за допомогою спеціального “Пристрою
для створення різних світлових режимів”, що апробований в експерименті і
дозволяє моделювати вірогідні фотоперіодичні зміни в організмі щурів впродовж
одного тижня [207]. Режим постійного освітлення здійснювався у так званому
світловому відсіку лампою денного світла потужністю 20 Вт освітленістю в 500 лк
на рівні дна кліток з тваринами. Для створення умов постійної темряви тварин
розміщували у темновому відсіку пристрою. Доступ під час годування до таких
тварин, а також необхідні маніпуляції з тваринами виконувалися тільки при
червоному світлі у 2 лк.
2.1.3. Моделювання гострої гіпоксичної гіпобаричної гіпоксії. Гостру гіпоксичну
гіпобаричну гіпоксію моделювали у модифікованій проточній барокамері шляхом
імітації підйому щурів на висоту 12000 м [208, 209] (з атмосферним тиском 19,4
кПа або 0,191 атм і парціальним тиском кисню рО2 в атомосферному повітрі 30,5
мм рт.ст. [210] ), яка є критичним рівнем для виживання тварин даного виду
[211] і близька до “смертельної площадки” – 12500м [212]. Досягнення висоти
відбувалося впродовж однієї хвилини. На “висотному плато” щурів утримували до
моменту другого агонального вдиху, після чого здійснювали “спуск” на попередню
нульову висоту, відновлюючи нормальний атмосферний тиск і життєдіяльність
тварин, що забезпечувало реоксигенацію організму після гострої гіпоксії.
2.1.4. Введення досліджуваних речовин. Після моделювання фотоперіодичних змін
певній пропорційній частині тварин за 30 хв до дії гострої гіпоксії вводили
епіфізарний гормон – мелатонін.
Мелатонін вводили внутрішньоочеревинно в 0,1% розчині етанолу в дозі 1 мг на
кг маси тіла [213-215]. Мелатонін вводили в фармакологічних дозах, які
перевищують фізіологічні концентрації циркулюючого мелатоніну, однак саме такі
дози при внутрішньоочеревинному введенні створюють фізіологічні концентрації
мелатоніну в лікворі [216]. Внутрішньоочеревинний шлях введення мелатоніну
обраний через те, що цей гормон здатний проходити гематоенцефалічний бар’єр і
діяти безпосередньо на клітини і внутрішньоклітинний простір головного мозку
[217].
Частині контрольних тварин відповідних серій досліджень вводили еквівалентну
кількість розчинника в той же час, що і піддослідним тваринам, решта тварин
залишалась інтактною. Групи дослідів, де показники у контрольних тварин з
введенням і без введення розчинника статистично не відрізнялися при обробці
результатів дослідження були об’єднані у спільну контрольну серію.
2.1.5. Евтаназія тварин та забір досліджуваного матеріалу. Евтаназію тварин
здійснювали під легким ефірним наркозом шляхом декапітації через 30 хв після
припинення дії гострої гіпоксії або через 1 год після введення досліджуваних
речовин, швидко забирали головний мозок, який промивали у холодному
фізіологічному розчині, обсушували фільтрувальним папером і зберігали в рідкому
азоті до подальших досліджень.
2.2. Методи оцінки впливу досліджуваних факторів
Стійкість тварин до гострої гіпоксії визначали за показниками тривалості
виживання щурів при моделюванні гіпоксії [206].
Оцінювали загальний стан центральної нервової системи за зміненого
фотоперіоду, за гострої гіпоксії та умов поєднаної дії обох факторів, вивчаючи
поведінкову активність щурів у тесті “відкрите поле” [218].
У базальних ядрах головного мозку біохімічними методами визначали стан процесів
пероксидації. Для дослідження брали структури: хвостате ядро (n.caudatus),
бліду кулю (globus pallidus)
- Київ+380960830922