РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика експериментальних тварин
Дослідження проведено на самцях і самках білих безпородних щурів віком 3 місяці. Загальна кількість використаних тварин склала 324 (174 самця та 150 самок).
Щурів утримували в умовах віварію кафедри фізіології на стандартному харчовому раціоні, при температурі 20-24о С, за умов вільного доступу до води та їжі. Для отримання нащадків із фіксованою датою народження самок із регулярними естральними циклами в стадії тічки підсаджували до статевозрілих самців із розрахунку дві самки на одного самця. Наступного дня визначали наявність сперматозоїдів у вагінальному мазку для фіксації дати настання вагітності [168]. Контрольну групу складали тварини, народжені інтактними самками. Дослідні групи формували з тварин, народжених самками, які з 15-го по 21-й день вагітності зазнавали щоденної одногодинної іммобілізації. Для стандартизації експериментальних умов з метою уникнення факторів, здатних вплинути на стрес-реактивність, визначення аналогічних показників проводили паралельно в дослідних та контрольних групах протягом весняно-літнього періоду.
Експериментальні втручання та евтаназія тварин проводилися з дотриманням міжнародних принципів Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985), ухвали Першого національного конгресу з біоетики (Київ, 2000). Комісією з питань біоетики Буковинського державного медичного університету (протокол № від 11.2006 р) порушень морально-етичних норм при проведенні науково-дослідної роботи не виявлено.
2.2. Моделювання іммобілізаційного стресу та пренатального стрес-синдрому
Іммобілізаційний стрес є широко розповсюдженим способом моделювання психоемоційного стресу завдяки своїй здатності спричиняти більш швидку та потужну активацію системи стрес-реактивності, ніж більшість інших відомих моделей стресорного впливу [169; 170]. Це пояснюється тим, що стан нервової і емоційної напруги, який виникає при іммобілізації, не приводить до активних соматомоторних проявів, здатних зменшувати психофізіологічне навантаження [171]. Внаслідок цього виникають зміни, що можуть зініціювати виникнення так званих ендогенних, або стресорних захворювань, або зіграти роль допоміжного етіологічного чинника їх появи [172, 173].
Іммобілізаційний стрес викликає швидкі зміни гормонального статусу організму, нейрохімічних систем мозку, морфологічного стану нейронів та зміни церебральної гемодинаміки [174; 175, 176, 177, 178]. Наприклад, ознаки функціональної активації в супраоптичному та паравентрикулярному ядрах гіпоталамуса і нейрогіпофіза виявлено вже після 30-хвилинної іммобілізації щурів. Це супроводжувалося посиленням синтезу нейросекрета і виведення нейрогормонів у кровотік, підвищенням рівня активності сукцинат- і малатдегідрогенази [179].
Після одногодинної іммобілізації у контрольних самців щурів виявлено зміни вмісту ?-ендорфіну в преоптичній ділянці, медіобазальному гіпоталамусі та мигдалеподібному комплексі. У цих же структурах та перегородці мозку після аналогічного втручання зростає вміст ?-передсердного натрійуретичного пептиду, стрес-протекторних (ПГЕ2 та 6-кето-ПГF1?), та простресорних (ПГF2? та ТхВ2) форм простаноїдів [180, 181].
Швидке реагування на іммобілізацію тих утворень мозку, які класично вважаються основними морфологічними та фізіологічними інтеграторами адаптивних функцій організму (паравентрикулярних та деяких інших ядер гіпоталамуса, гіпокампа, мигдалика, блакитної плями, перегородки) підтверджено підсиленням в них експресії генів раннього реагування c-fos c-jun, c-myc, jun-B, jun-D та ін [182, 183]. Встановлено, що експресія гена c-fos у мозку починає зростати вже на 5-й - 7-й хв іммобілізації [184], а в латеральній перегородці, преоптичній ділянці, паравентрикулярному ядрі гіпоталамуса, медіальному відділі мигдалика, блакитній плямі найбільш виражене підсилення його експресії мало місце на 60-й хв іммобілізаційного стресу [185].
Сукупність наведених фактів підтверджує адекватність обраного нами терміну іммобілізації меті дослідження.
Для відтворення експериментального пренатального стрес-синдрому використана модель, запропонована I.Ward et al. [186], згідно якої самки з 15-ї по 21-шу добу вагітності щоденно зазнавали одногодинного жорсткого іммобілізаційного стресу (шляхом фіксації в положенні на спині). Ефективність даної моделі щодо довготривалих порушень нейроімуноендокринних механізмів у нащадків підтверджена багатолітніми дослідженнями співробітників відділу ендокринології репродукції та адаптації Інституту ендокринології та обміну речовин ім. В.П.Комісаренка АМН України (завідувач - доктор медичних наук, член-кореспондент НАН і АМН України, професор, заслужений діяч науки і техніки України О.Г. Резніков) [187, 188].
Для створення функціонального навантаження на систему стрес-реактивності з метою виявлення прихованих імпринтингових порушень частину тварин обох груп по досягненні тримісячного віку піддавали дії одногодинної іммобілізації.
2.3. Обгрунтування вибору структур для дослідження
Для своїх досліджень ми обрали лімбіко-гіпоталамічні структури мозку, оскільки за даними літератури, саме вони є структурними еквівалентами стрес-реакції [171, 189, 190], регуляції репродуктивних процесів [188], а їх нейрохімічні системи є складовими системи стрес-реалізації та стрес-обмеження [180]. Крім того, нейрони цих структур мають високу чутливість до статевих гормонів та інших імпринтингових чинників упродовж пренатального періоду онтогенезу [180, 188]. Їх нейромедіаторні та нейропептидні механізми також набувають функціональної активності в останньому триместрі вагітності, що робить ці структури потенційними мішенями змін мікрооточення, які виникають під впливом пренатального стресу. Насамкінець, важливим є те, що дані утворення мозку характеризуються статевою диморфністю [168, 191], що в