РОЗДІЛ 2
МАТЕРИАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Об’єктом наших досліджень стала субстанція густого екстракту з листя Винограду
культурного, отримана на кафедрі хімії природних сполук НфаУ, під керівництвом
проф. Кисличенко В.С. Спосіб отримання та гепатопротекторна дія субстанції
захищені деклараційним патентом на корисну модель [77].
Густий екстракт з листя Винограду культурного за фізико–хімічними властивостями
(фізичним станом) є в’язкою масою темно-коричневого кольору однорідної густої
консистенції з характерним запахом та кислуватим смаком. Погано розчинний у
воді, 96% етиловому спирті, хлороформі, діетиловому ефірі, розчинний у гарячій
воді, 40% етиловому спирті.
До складу субстанції входять поліфенольні сполуки: дубильні речовини (загальний
вміст 10,85%); флавоноїдні глікозиди та аглікони (2,34%); оксикоричні кислоти
(загальний вміст в перерахунку на хлорогенову кислоту 1,78%). Загальний вміст
поліфенолів в перерахунку на галову кислоту становить 11,99%.
У складі густого екстракту з листя Винограду культурного ідентифіковано такі
флавоноїдні аглікони, як кверцетин (3,5,7,3ў,4ў-пентагідроксифлавон), кемпферол
(3,5,7,4ў-тетрагідроксифлавон), ізорамнетин
(3,5,7,4ў-тетрагідрокси-3ў-метоксифлавон), апігенін (5,7,4ў-тригідроксифлавон),
лютеолін (5,7,3ў,4ў-тетрагідроксифлавон) (Рис.2.1). Дубильні речовини, що
входять до складу субстанції представлені, головним чином, галовою та елаговою
кислотами (Рис.2.2). Гідроксикоричні кислоти представлені феруловою
(4-гідрокси-3-метоксикоричною), кавовою, хлорогеновою кислотами. В складі
субстанції виявлено полігідроксистільбени (ресвератрол), кумарини (умбеліферон,
ескулетин). До комплексу біологічно активних сполук входять також вітаміни,
амінокислоти, інші азотовмісні сполуки, цукри [51,149].
Кверцетин
кемпферол
ізорамнетин
апігенін
Лютеолін
Рис. 2.1. Флавоноїдні аглікони
Галова кислота Елагова кислота
Рис. 2.2. Дубильні речовини
Як основний препарат порівняння був використаний вітчизнаний гепатопротектор
силібор. До складу силібору (виробництво ФФ “Здоров’я”, м. Харків, Україна)
входять флаволігнани із плодів Розтопші плямистої (Silybum marianum L.,
Asteraceae). Основними компонентами силібору є: силібінін (Рис.2.3),
силідіанин, силікристин, кверцетин, ферулова та кавова кислоти.
Рис. 2.3. Силібінін
Субстанція силібору – коричнювато-жовтий аморфний порошок із слабким запахом.
Практично не розчиняється у воді, легко розчиняється у 70% спирті.
Основною сферою застосування силібору у лікарській формі таблеток є практична
гепатологія. Гепатопротекторний ефект препарату зумовлений, насамперед,
гальмуванням перекисного окиснення ліпідів та стабілізацією, внаслідок
означеного, мембран гепатоцитів, а також його метаболічними ефектами.
Силібор застосовували в дозі 25 мг/кг, що визначена як ЕД30 [33].
І етап
ІІ етап
ІІІ етап
Рис. 2.4. Логічна схема дослідження
З огляду на поліфенольний склад досліджуваної субстанції першим етапом наших
досліджень стало вивчення антиоксидантних властивостей густого екстракту з
листя Винограду культурного (Рис 2.1.).
На початковому етапі досліджень відповідно до головних положень “Європейської
конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для
експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985) [32] вивчення
впливу субстанції густого екстракту з листя Винограду культурного на розвиток
процесів перекисного окислення ліпідів проводили в умовах in vitro. Вивчення
антиокиснювальних властивостей густого екстракту з листя Винограду культурного
в системі in vitro проводили на моделі спонтанного перекисного окиснення
ліпідів в гомогенаті печінки [17]. Наважку печінки щура використовували для
приготування 25% гомогенату на 0,1 М тріс-хлоридному буфері (рН=7,0).
Досліджуваний екстракт додавали до отриманого гомогенату з розрахунку 0,5; 1 та
2 мг на 1 г тканини печінки у вигляді тонкодисперсної суспензії, стабілізованої
твіном-80. Свіжоотримані суміші по 0,2 мл вносили до пробірок з 3 мл
тріс-хлоридного буферу (рН=7,4). Інкубацію проводили при 37оС протягом 10,
15 та 20 хвилин у водяному термостаті при постійному струшуванні. Реакцію
припиняли додаванням 1,5 мл 40% розчину трихлороцтової кислоти, після чого в
інкубаційному середовищі визначали вміст ТБК-реактантів, що є кінцевими
продуктами перекисної деградації ненасичених кислот, зокрема тих, що входять до
складу мембранних фосфоліпідів. Визначення вмісту ТБК-активних продуктів
проводили за допомогою реакції з тіобарбітуровою кислотою та подальшим
фотометруванням. В якості препарату порівняння був використаний a-токоферол
(природний антиоксидант), що додавався до гомогенату у вигляді 0,5% емульсії
стабілізованої твіном-80 з розрахунку 1 мг на 1 г тканини печінки. Розрахунок
кількості екстракту, яку вносили до інкубаційного середовища, проводився на
підставі такої його кількості, що потрапляє через систему воротної вени до
печінки при одноразовому пероральному введенні густого екстракту з листя
Винограду культурного в дозах 25, 50 та 100 мг/кг відповідно, при умові
100%-вої всмоктуваності. Аналогічним чином розраховувалась і кількість
a-токоферолу, вона відповідає ЕД50, яка дорівнює 50 мг/кг.
Скринінгові дослідження антиоксидантної та антицитолітичн