Корецька Н.В. Вплив лектинів на спонтанний та індукований мутагенез у Bacillus subtili

<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ<br />2.1. Бактеріальні штами<br />Для дослідження особливостей можливої антимутагенної дії лектинів була<br />використана велика колекція rec-мутантів B.subtilis. Доцільність такого вибору<br />пов'язана з тим фактом, що більшість фундаментальних даних, котрі розкрили<br />біохімічну основу мутаційного процесу, були одержані в експериментах саме із<br />мутантами мікроорганізмів. <br />Колекція мутантів B. subtilis з Всесвітнього музею культур бацил [145] була<br />одержана від професора А.А.Прозорова, Інститут загальної генетики (ІОГен,<br />Москва, Росія) та з музею колишнього Ленінградського інституту ядерної фізики<br />(ЛІЯФ). Мутантні штами мають спільне походження від еталонного штаму B.<br />subtilis (Мarburg 168) та містять мутації в генах системи<br />репарації/реплікації/рекомбінації. <br />Контрольні штами були представлені такими, що мають неушкоджену систему<br />репарації: SB25 (rec+ trpC2 hisH) та BD170 (rec+ thr5 trpC2). <br />Серед rec- мутантів B.subtilis для роботи були відібрані штами, котрі<br />характеризуються підвищеною чутливістю до мітоміцину С, УФ-опромінення, різним<br />рівнем зниження частот гомологічної та гетерологічної трансформацій і<br />трансдукції, а також підвищеним рівнем спонтанного та індукованого мутагенезу,<br />а саме: <br />recР149 (recP trp his) - підвищена частота спонтанного мутагенезу, спонтанна<br />індукція профага, порушено процес репаративного синтезу ДНК, нуклеаза<br />відрізняється від відомих екзонуклеаз B.subtilis i, можливо, бере участь у<br />незаконній рекомбінації; <br />BD193 (recB3 thr5 trpC2) - пригнічена індукція профагів;<br />BD194 (recA1 trpC2) - пригнічена індукція фага, ослаблена індукція<br />SOS-репарації; <br />BD241 (recL16 thr5 trpC2) - пригнічені процеси постреплікативної репарації;<br />g5y1618 (recF18 trpC2 metB4) - знижена індукція профага, відсутня репарація<br />одноланцюгових розривів ДНК; <br />PB1640 (recG40 aroB2 hisH2 trpC2 tyrA1) - порушені процеси репарації, знижена<br />індукція профага; <br />VUB221 (recF15 novA1 trpС2 thr5) - блокована термоіндукція профага;<br />BD237 (recA8 thr5 trpC2) - послаблена індукція SOS-репарації;<br />GSG2258 (add5 hisH2 metB5) - знижена активність АТФ-залежної ДНКази - ферменту,<br />який здійснює функції ДНК-екзонуклеази; <br />BD224 (recE4 thr5 trpC2) - знижена активність АТФ-залежної ДНКази. <br />PB1663 (his42 recH342 trpC2) – підвищена температурочутливість, знижена<br />активність АТФ-залежної дезоксирибонуклеази; <br />Детальніше властивості мутантів охарактеризовані в таблиці 2.1.<br />В окремих експериментах був застосований штам-продуцент лектину В-7014 з<br />колекції Інституту мікробіології і вірусології НАНУ. <br />Один з етапів роботи був присвячений дослідженню впливу лектинів на виникнення<br />спонтанних реверсій у генетично нестабільних мутантів, одержаних за допомогою<br />еукаріатичної ДНК. Для цього були використані генетично нестабільні мутанти,<br />одержані за допомогою сумарного препарату чужорідної ДНК: комерційного<br />препарату ДНК оселедця (FLUKA, Швейцарія) – штам Leu-5-3 та рекомбінантної<br />плазміди pAL1, похідної від pUC18, що містить за сайтом BamH1 полілінкера один<br />Alu-повтор геному людини (біля 300 н.п.) - штам Alu-1 (колекція відділу<br />генетики людини ІМБіГ) [179,180]. З метою підтвердження інсерційної природи<br />мутації Alu-1 проводили полімеразну ланцюгову реакцію із застосуванням<br />праймерів до канонічного Alu-повтору людини [181]. <br />Таблиця 2.1 <br />Характеристика мутантів B.subtilis, використаних в роботі<br />Назва<br />штаму<br />Генотип<br />Характеристика<br />мутанту<br />SB25<br />rec+ trpC2 hisH<br />непошкоджена система репарації<br />BD170<br />rec+ thr5 trpC2<br />непошкоджена система репарації<br />PB1663<br />recH342 his42 trpC2<br />підвищена температурочутливість, знижена активність АТФ-залежної<br />дезоксирибонуклеази <br />recP149<br />recP149 trpC2 hisH<br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, чутливість до<br />УФ, підвищена частота спонтанного мутагенезу по ряду локусів <br />BD193<br />recB3 thr5 trpC2<br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, чутливість до<br />метилметансульфонату та до Х-променів; знижена частота трансдукції під дією ДНК<br />фага SPP1 <br />BD194<br />recA1 thr5 trpC2 <br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, чутливість до<br />метилметансульфонату, послаблена індукція SOS-репарації, порушена індукуюча<br />система рестрикції-модифікації <br />Продовження таблиці 2.1<br />BD237<br />recA8 thr5 trpC2<br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, чутливість до<br />метилметансульфонату, послаблена індукція SOS-репарації, порушена індукуюча<br />система рестрикції-модифікації <br />BD241<br />recL16 thr5 trpC2<br />порушені процеси трансдукції, послаблені процеси постреплікативної репарації<br />BD246<br />recM13 thr5 trpC2<br />" – "<br />GSY1618<br />recF18 trpC2 metB4<br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, чутливість до<br />метилметансульфонату та до Х-променів <br />VUB221<br />recF15 novA1 trpC2 thr5<br />" – "<br />PB1640<br />recG40 aroB2 hisH2 trpC2 tyrA1<br />зниження плазмідної та хромосомної трансформації та трансдукції, не впливає на<br />ефективність гомологічної трансдукції фагом PBS1, порушені процеси репарації <br />GSY2258<br />add-5 hisH2 metB5<br />знижена активність АТФ-залежної ДНКази<br />BD224<br />recE4 thr5 trpC2<br />" – "<br />BD293 <br />polC thr5 trpC2 <br />порушена функція ДНК-полімерази III<br />2.2. Лектини<br />В роботі були застосовані комерційні препарати лектинів, з відомою структурою<br />та вуглеводною специфічністю, вітчизняного виробництва (''ЛЕКТИНОТЕСТ'', Львів,<br />Україна), котрі належали до трьох найбільш поширених класів рослинних<br />лектинів: <br />1 - лектини бобових - лектин дощу золотого (LAA), лектин конавалії мечовидної<br />(СonA) та лектин квасолі звичайної – РНА-P (сумарний препарат); <br />2 - лектини з хітинзв’язуючим доменом (лектин зародків пшениці - WGA та лектин<br />картоплі - STA); <br />3 - рибосомінактивуючі</p>