РОЗДІЛ 2
Матеріал та методи досліджень
2.1. Матеріал дослідження
Лімфоцити (Т-хелпери/індуктори та Т-супресори/цитотоксики) та моноцити були
виділені з периферійної крові 45 здорових донорів чоловічої статі віком від 20
до 35 років (середній вік – 27,30±1,37 років).
ПГН золотавого стафілокока та ЛПС палички синього гною були виділені нами з
клітинних стінок штамів, ізольованих від пацієнтів з хірургічною патологією,
які находились на лікуванні в хірургічному відділенні Луганської міської
багатопрофільної лікарні № 1 у червні-серпні 2006 р.
Робота виконувалась у відповідності до біоетичних норм з дотриманням
відповідних принципів Гельсінської декларації прав людини, Конвенції ради
Європи про права людини і біомедицини та відповідних законів України. Всі
обстежені дали письмову згоду на участь у дослідженні.
2.2. Методи досліджень та статистична обробка одержаних результатів
Кров забирали ранком, натще, з пальця на загальний аналіз і з вени ліктьового
згину для імунологічних і біохімічних досліджень. Кров вносили до стерильних
скляних пробірок, які містили 0,2 мл гепарину, перемішували і для одержання
плазми відстоювали протягом 2 годин у термостаті при 37єС. Імунологічні та
біохімічні дослідження проводили в науковій лабораторії кафедри патофізіології
Луганського державного медичного університету (завідувач кафедри – професор
Н.К. Казімірко).
Популяції моноцитів периферійної крові одержували за допомогою центрифугування
на подвійному градієнті щільності 1,077 фіколу-верографіну за H.R. Recalde
(1994) [70, 89]. Чистоту суспензії моноцитів (89-98 %) підтверджували
імунофлуоресцентним методом з використанням моноклональних антитіл до
рецепторів CD14. Життєздатність клітин у суспензії підтверджували в тесті з
трипановою синькою (вона складала 89-93 %).
Виділення лімфоцитів з периферійної крові здійснювали в градієнті щільності
фікол-верографін. З 76 % розчину верографіну готували 14,3 % робочий розчин: до
20 мл ампульного верографіну додавали 86,2 мл бідистильованої води і 0,1 мл 0,1
н розчину NaOH. Щільність виготовленого розчину (1,077 г/мл) перевіряли
ареометром. Нашаровували 4 мл гепаринізованої венозної крові, розведеної 1:1
забуференим фосфатним буфером ізотонічним розчином натрію хлорид (рН=7,2), на
поверхню розчину верографіну (4 мл) і негайно центрифугували при 1500 обертів
на хвилину протягом 40 хвилин. Вміст пробірки розділявся на 4 прошарки (зверху
вниз): плазма, кільце мононуклеарних клітин, верографін, еритроцитарна маса.
Кільце лімфоцитів і верхній прошарок верографіну відсмоктували пастерівською
піпеткою. Лімфоцити тричі відмивали від верографіну при 1000 обертах на хвилину
по 10 хвилин. Якщо спостерігали домішок еритроцитів, їх руйнували 0,83 %
розчином амонію хлорид на трис-буфері (рН=7,65). Для підготовки суспензії
лімфоцитів у концентрації 2*109 /л проводили розрахунок за формулою: В=
(а/40-1)*с, де а - кількість лімфоцитів у камері Горяєва, с - кількість
суспензії лімфоцитів, залишених у пробірці; В - кількість фосфатно-буферного
розчину, яку необхідно додати. Суправітальне забарвлення виділених лімфоцитів
трипановим синім свідчило про життєздатність 98-99 % клітин.
Кількість Т-хелперів/індукторів, Т-супресорів/цитотоксиків визначали
цитотоксичним методом з використанням моноклональних антитіл [59].
Клітинами-мішенями для постановки реакції служили лімфоцити периферійної крові,
цитотоксичними антитілами - моноклональні антитіла СD4 та СD8 у розведенні
0,1-0,2 мкг/мл. Літичною системою служила сироватка кролів, попередньо
перевірена на нетоксичність. Для тестування використовували 96-ямкові планшети,
у лунки яких поміщали по 0,025 мл моноклональних антитіл і суспензії лімфоцитів
у концентрації 2-4*(6 lg)/мл і інкубували при 37°С протягом 30-40 хвилин. Потім
надосадову рідину відбирали і добавляли по 0,05 мл свіжого комплементу, після
чого проводили інкубацію при 37°С протягом 1 години. Для припинення
цитотоксичної реакції планшети поміщали в холодильник на 10-15 хвилин, потім до
лунок вносили 0,1 % розчин трипанової синьки і враховували результати в камері
Горяєва під світловим мікроскопом.
ПГН отримували з клітинних стінок золотавого стафілокока за методом P.K.
Peterson і колег [125, 129]. Культури золотавих стафілококів вирощували в
середовищі, яке містило пептонний дріжджовий екстракт (0,5 % екстракт дріжджів,
1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкози, р=7,2-7,4), та інкубували при 37єС
протягом 2-4 годин. Потім стафілококи інокулювали в 10 л вищевказаного
середовища та інкубували при 37єС протягом 24 годин із струшуванням.
Стафілококи одержували центрифугуванням (5000 g, 4єС, 10 хвилин) і тричі
відмивали холодною дистильованою водою. Стафілококові клітини руйнували копром
з стерильними скляними кульками діаметром 0,1 мм (фірми Biospec Products, USA).
Копер використовували протягом 5 циклів по 90 секунд кожний. Після седиментації
кульок супернатант збирали і кульки тричі промивали. Супернатанти після
промивання центрифугували (14000 g, 4єС, 4 хвилини), а потім виділяли білий
верхній прошарок гранул, який містив стінки стафілококів. Клітинні стінки
ресуспендували в холодній дистильованій воді і промивали. Для виявлення
інтактних клітин стафілококів використовували фарбування за Грамом. Клітинні
стінки ресуспендували в 2 % розчині натрію додецилсульфату та інкубували
протягом 12 годин. Матеріал двічі відмивали дистильованою водою, а потім 0,05 М
NaH2PO4 (рН=7,0) і 0,05 М трис-хлористоводневою кислотою (рН=7,5). Клітинні
стінки ресуспендували в 200 мл розчину 0,05 М трис-хлористоводневої кислоти,
який містив 5 ммоль MgCl2
- Київ+380960830922