РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на 776 белых беспородных половозрелых крысах обоего пола
массой 160-200 г в лаборатории кафедры фармакологии Луганского государственного
медицинского университета (ЛугГМУ), сертифицированной Государственным
фармакологическим центром (ГФЦ) МЗ Украины (свидетельство № 41 от 30 мая 2002
г. и № 07 от 29 сентября 2005 г.) в полном соответствии с требованиями Комиссии
по биоэтике ЛугГМУ (протокол № 11 от 28 марта 2007 г.).
В экспериментах использовались животные после прохождения 14-ти дневного
карантина в условиях вивария ЛугГМУ. Все крысы находились на стандартном
нормированном пищевом рационе (гранулированный корм) со свободным доступом к
воде.
Методические принципы и методы, используемые в работе, выполнены согласно
рекомендаций и указаний ГФЦ МЗ Украины [276, 277], а также
инструктивно-методических материалов, разработанных учеными стран ЕС
[277-280].
Эвтаназию животных осуществляли передозированием эфирного наркоза в
соответствии с требованиями Комиссии по биоэтике Луг ГМУ.
Экспериментальной моделью служил патологических процесс, развивающийся на фоне
ЗЧМТ, моделируемой с помощью специального устройства по модифицированному на
кафедре фармакологии нашего университета способу, который заключается в
нанесении дозированного по силе и ориентированного по локализации удара
свободнопадающим грузом массой 45 г на теменную область черепа крысы,
зафиксированной в усовершенствованной камере Когана [281] и находящейся под
легким эфирным наркозом.
Опыты проводились на 4 группах животных: интактной, контрольной, опытной и
референтной. Крысам опытной серии через 30 минут после травматического
повреждения головного мозга и ежедневно на протяжении всего эксперимента (6
дней) 1 раз в сутки в утренние часы внутрибрюшинно вводили изучаемый
потенциальный церебропротектор – б-липоевую кислоту (производство Одесского ГП
«Биостимулятор») в дозе 100 мг/кг в виде 0,5 % водного раствора [282]. В
качестве препарата сравнения использовали пирацетам (производство "Фармак",
Украина), который животные референтной группы получали в виде 20 % раствора в
дозовом режиме, аналогичном б-липоевой кислоте. Контрольной серии крыс вводили
в вышеупомянутом режиме дозирования эквиобъемное количество физиологического
раствора натрия хлорида.
Все исследования проводились в динамике: через 1, 3 и 6 суток от момента
нанесения дозированного удара в следующих биосубстратах: цельной крови,
сыворотке крови и коре головного мозга. 20% гомогенат ткани мозга готовили на
охлажденном изотоническом растворе натрия хлорида.
Состояние окислительного гомеостаза в условиях моделируемой формы ТБГМ
оценивали по содержанию основных компонентов ферментативного (СОД и каталазы) и
неферментативного (свободные SH-группы и глутатион восстановленный) звеньв АОС
защиты организма.
Активность СОД изучали с использованием спектрофотометрического метода,
основанного на способности данного фермента ингибировать реакции окисления
кверцетина с максимумом поглощения при длине волны 406 нм [283].
Метод определения активности каталазы основан на свойстве этого энзима
разлагать молекулы перекиси водорода на воду и кислород и давать, при
взаимодействии с солями молибдена и неизрасходованной перекисью водорода,
стойкое интенсивное окрашивание исследуемых проб, максимум поглощения которого
приходится на значение л=410 нм [284].
Содержание глутатиона восстановленного в сыворотке крови и коре головного мозга
устанавливали согласно реакции сульфгидрильных групп последнего с реактивом
Эллмана с образованием окрашенного продукта, оптически идентифицируемого при
длине волны 400 нм [285].
Определение уровня свободных SH-групп проводили по модифицированному методу
G.L.Ellman [286], принцип которого основан на реакции образования дисульфидных
связей в присутствии 5,5ґ-дитиобис-2-нитробензоата, интенсивность окраски
которого оценивали по изменению оптической плотности с использованием
фиолетового светофильтра (л=412 нм).
Степень обеспеченности организма эндогенными антиоксидантами анализировали
путем исследования ПРЭ [287].
С целью более корректного суждения о церебропротекторной эффективности
б-липоевой кислоты в плане ее способности противостоять окислительному стрессу
при молируемой форме ТБГМ определяли фактор (F) антиоксидантной активности по
формуле, согласно методических рекомендаций ГФЦ МЗ Украины [276]:
F=, где
А – активность каталазы (кат/л);
В - активность супероксиддисмутазы (усл. ед);
С – количество ТБК-продуктов (нмоль/г).
Интегральным показателем, отражающим интенсивность течения в организме
процессов липидпероксидации и активности основных компонентов АОС избрана БХЛ,
которую регистрировали на люминометре “Emillite-1105” совместного
австро-германо-российского производства в сыворотке крови крыс в течении 5
минут и гомогенате коры головного мозга – в течении 3 минут. Спектральный
диапазон прибора составляет 350-390 нм, а диапазон измерений – 103–1010
фотон/с. Исследуемые биосубстраты предварительно подвергались 20-ти минутной
инкубации при температуре 37°С. Перед проведением измерений записывали
фотоновые значения и спонтанный уровень БХЛ в течении 1 минуты. В работе
использован усовершенствованный сотрудниками кафедры фармакологии ЛугГМУ метод
определения в тканях интенсивности сверхслабого свечения, индуцированного 3 %
раствором перекиси водорода [288].
Кинетику БХЛ оценивали по следующим параметрам: I1, I2, ф, Ik и S. Расчет
исследуемых параметров проводили с использованием специально разработанной на
кафед
- Київ+380960830922