РОЗДІЛ 2
Матеріали і методи досліджень
Дисертаційна робота виконувалась протягом 2003 – 2006 рр. у науково-дослідній
лабораторії кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського державного
аграрного університету і являється частиною планової теми кафедри “Вивчення
ролі мікроскопічних грибів та мікотоксинів у патології сільськогосподарських
тварин”. Видова ідентифікація деяких ізолятів Fusarium spp., Penicillium sp. та
Aspergillus spp. проводилась у відділі фізіології і систематики мікроміцетів
Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України спільно
з кандидитом біологічних наук О.В. Соколовою. Підтвердження кількісного
визначення вмісту охратоксину А в субстратах та його дозування з метою
постановки експериментального охратоксикозу перепела японського виконувались у
відділі хіміко-токсикології і радіології Київської міської державної
лабораторії ветеринарної медицини, який акредитований у системі ISO 17025 DAP.
Вивчення поверхневої та глибинної мікобіоти зерна ячменю, дослідження її
токсигенних властивостей та особливостей токсикобіологічної дії мікотоксинів
проводили за схемою зображеною на рис. 2.1.
2.1. Методи мікологічних досліджень
Для дослідження були відібрані 100 зразків зерна ячменю урожаю 2003 та 2004 рр.
з трьох фізико-географічних регіонів країни в період зберігання. Зерно ячменю,
вирощене в зоні Полісся, було відібране у Чернігівській та Сумській областях.
Із лісостепової зони відбір проводився у Київській, Вінницькій та Черкаській
областях, а матеріал із степової зони був доставлений із Запорізької області та
з АР Крим. Проведено також дослідження зразків зерна з Донецької та Черкаської
областей, згодовування якого сільськогосподарським тваринам викликало
захворювання на мікотоксикози.
Зразки для досліджень відбирались у сільськогосподарських та зернопереробних
підприємствах названих вище областей, а також були надані районними і обласними
насіннєвими інспекціями. Відбір зерна для мікологічного дослідження проводили,
керуючись методичними вказівками з санітарно-мікологічної оцінки і поліпшення
якості кормів [48], у відповідності до ГОСТ 13586, 3-83 та ДСТУ 3570 – 97.
Зерно ячменю
Органолептичне дослідження Визначення кількісного та якісного складу мікобіоти
Виділення чистої культури
Пересів і культивування штамів на середовищах, придатних
для токсиноутворення
Визначення токсичності хімічними методами, ТШХ, ВЕРХ
Визначення вмісту токсинів та особливості токсичної
дії біологічними методами
Дослідження клінічних, біохімічних, патологоанатомічних та гістологічних
показників дослідних тварин
Рис. 2.1 Схема експериментальних досліджень
При вивченні мікобіоти досліджувались такі сорти ячменю як Цілина, Неофіт,
Скарлет, Цезар, Терен, Осма-еліта, Прима Білорусії, Невада, Толар, Посадина,
Прерія, Адепт, Дерибас, Основа, Пеяс, Гетьман, Вакула, Галактик, Гонор та
Одеський 115.
Епіфітну мікофлору виявляли методом прямої інокуляції, для чого нативні зерна
розміщали у чашки Петрі по поверхні середовища Чапека. З кожного зразка
матеріал висівали в 4 чашки по 10 зерен у кожну. Для виділення ендофітної
мікобіоти зерно перед посівом обробляли 3% розчином формаліну протягом трьох
хвилин. Після закінчення експозиції для нейтралізації дезінфектанту матеріал
промивали стерильною водою, до якої додавали 5 % розчин аміаку. Культивування
виконували в термостатах при 24 °та 37 °С протягом 7 діб.
Для встановлення ступеня контамінації матеріалу мікроміцетами (кількість
колонієутворюючих одиниць в 1 г зерна) застосовували метод серійних розведень.
Зерно подрібнювали на електричному млинку та готували серійні розведення. Для
чого наважку подрібненого зерна масою 10 г заливали стерильною водою до 100 мл
та струшували протягом 20 хвилин. Після цього готували послідовні розведення
1:100, 1:1000 та 1:10000, вносили по 1 мл на поверхню середовища Чапека,
висіваючи суспензії з розрахунку одне розведення на дві чашки Петрі. Інкубацію
проводили при 24 та 37 °С, і колонії підраховували на 3 – 5-й дні після посіву.
Вміст колонієутворюючих одиниць у 1г зерна вираховували за формулами:
С= , N=
де С – вміст діаспор грибів в 1 г субстрату; Km, K1, K2 і т.д. – знаменники
максимального і використаних розведень, починаючи з мінімального; V – об’єм
висіяної суміші (мл); N1, N2 і т. д. – кількість діаспор, спочатку середнє, а
потім в кожному розведенні [5].
З метою отримання чистих культур штами Aspergillus spp. і Penicillium spp.
висівали на скошене середовище Чапека, а Fusarium spp. – на сусло-агар.
Ідентифікацію виділених штамів до видів і різновидів проводили з використанням
загальноприйнятих визначників [7, 8, 64, 76, 125]. У випадку ізоляції штамів
фузаріїв, які не утворювали конідій використовували метод мікрокультури для їх
видової ідентифікації [10]. В основі методу полягає принцип швидкого виснаження
джерел поживних речовин за наявності оптимальної вологості повітря та
температури. Застосовуючи розроблений метод мікроскопічної культури, через 24 –
72 години можна отримати типове спороношення у різних видів фузаріїв та
простежити цикл їх розвитку – від проростання до утворення конідій.
На внутрішню сторону верхньої кришки стерильної чашки Петрі піпеткою наносили
ряди крапель рідкого середовища Чапека на відстані до 2 см один від одного. Дно
нижньої чашки накривають 1 – 3 шарами фільтрувального паперу і наносять на
нього 2–3 мл дистильованої стерильної води, не допускаючи надлишкового
зволоження. Середовище інокулюють конідіями перед нанесенням крапель, а при
відсутності конідій в посівному матеріалі – міцелієм. Інокуляцію здійснювали за
допомогою мікологічного гачка, чашку з фільтрувальним папером накривали кри
- Київ+380960830922