РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріали і методи
Робота виконана впродовж 2003-2007 рр. в Сумському національному аграрному університеті. Дослідження проводились на базі Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів, Товариства з обмеженою відповідальністю "Алтекс", Закритого акціонерного товариства науково-виробничого аграрного підприємства "Новогалещинська біофабрика", Київської міської державної лабораторії ветеринарної медицини, клінік ветеринарної медицини м. Києва.
Епізоотичну ситуацію щодо дерматомікозів собак і котів вивчали на основі результатів мікологічних досліджень. Для визначення видового складу збудників дерматомікозів проводили відбір патологічного матеріалу від собак і котів з ураженнями шкіри та з клінічними ознаками дерматомікозів для наступних мікологічних досліджень.
Мікологічні дослідження проводили загальноприйнятими методами, які включали: відбір, мікроскопію і посів патологічного матеріалу (зіскрібки шкіри, волосся) на живильні середовища, виділення та ідентифікацію збудника, вивчення морфологічних, культуральних та біологічних властивостей.
Патологічний матеріал відбирали на периферії пошкодженої і здорової ділянок шкіри скальпелем, пінцетом або за Маккензі - Mackenzie, (1961), шляхом вичісування шерсті зубною щіткою або гребінцем, стерилізованими впродовж 30 хвилин в 0,1 %-му розчині хлоргексидину. Перед мікроскопічними дослідженнями матеріал просвітлювали в 10-15 % -тному розчині лугу (NaOH), наносили на предметне скло в краплю розчину спирт-гліцерин-вода (1:1:1) і накривали покривним склом, а для посіву культур його вносили на живильне середовище. Патологічний матеріал для мікроскопії не завжди обробляли розчинами лугів. Мікроскопію зіскрібків шкіри і волосся проводили при збільшенні х 8, 40, встановлюючи пошкодження волосся грибами [36, 7275, 136, 193].
Виділення культур грибів проводили загальноприйнятими методами шляхом висіву патологічного матеріалу на агаризовані живильні середовища: Сабуро, бульйон Сабуро, Сабуро з хлорамфеніколом, сусло-агар в чашки Петрі [25-29, 35, 36, 38, 71, 72]. Культивували ізоляти грибів за температури 27 ±1 0С впродовж 10-14 діб, періодично визначаючи макро- і мікроструктуру грибів.
Чисті культури дерматофітів отримували шляхом пересіву інокулюму колонії гриба мікологічним гачком у пробірки з живильним середовищем [36]. Ідентифікацію чистих культур збудників трихофітії і мікроспорії проводили за морфологічними, культуральними ознаками (тип росту, колір, консистенція, форма грибних колоній, ростучий край, реверзум) та за допомогою визначників грибів [29, 67, 69, 215]. Для проведення мікроскопічного дослідження мікологічним гачком відбирали частину колонії гриба і розміщували в краплю гліцерин-спирт-вода (1:1:1) на предметне скло, накривали покривним склом, злегка роздавлюючи краплю та досліджували при збільшенні х 8, 40. Матеріал для дослідження брали так, щоб у препараті були периферія колонії та її центральна частина (сектор). Досліджували нефарбовані препарати. Чисту культуру Microsporum canis було отримано на 2-3 генерації культивування, Trichophyton mentagrophytes - 1-2. Чистоту культур визначали шляхом посіву грибної суспензії з культур та посіву виділених культур уколом на живильні середовища Сабуро (рідке, тверде), сусло-агар (70 за Баллінгом), МПБ, МПА, МППБ, тіогліколеве і культивування за температури 27 ±1 0С та 37 0С впродовж 10-14 діб. Чисті культури дерматофітів додатково висівали на експериментальне індикаторне живильне середовище ТВС, яке при рості чистої культури дерматофіта змінювало свій колір із жовтогарячого на червоний різної інтенсивності. Така зміна кольору живильного середовища пов'язана з біохімічними особливостями дерматофітів.
Вивчення морфологічних і культуральних властивостей епізоотичних штамів Microsporum canis проводили на агаризованому бульйоні Сабуро, а епізоотичних штамів Trichophyton mentagrophytes - на сусло-агарі шляхом їх культивування впродовж 14-15 діб за температури 27 ±1 0С. Моноколонії дерматофітів отримували посівом їх уколом та методом послідовних розведень суспензії грибних клітин [28, 36, 38, 71, 72].
Патогенність епізоотичних штамів Trichophyton mentagrophytes і Microsporum canis визначали за методом нашкірного зараження лабораторних тварин (кролів, морських свинок) [28, 36, 38, 79]. Для визначення патогенності дерматофітів із 14-15 добових культур готували грибні гомогенати, які в кількості 0,5 см3 втирали в попередньо депільовану і скарифіковану шкіру в ділянці холки, завбільшки 3 х 3 см. Після інокуляції дерматофітів за тваринами спостерігали впродовж 30-45 діб, враховуючи наявність/відсутність ураження шкіри, його характер, тривалість.
При визначенні вірулентності та заражаючої дози дерматофітів Trichophyton mentagrophytes ТМ-48 К і Microsporum canis 65 К у грибних гомогенатах підраховували кількість мікроконідій в камері Горяєва. Зараження морських свинок, кролів проводили гомогенатами з кількістю мікроконідій: 1,0 х 106; 2,5 х 106 та 5,0 х 106, які в об'ємі 0,5 см3 втирали в підготовлену шкіру.
При відборі перспективних штамів дерматофітів, претендентів на вакцинні, контрольні, приділяли увагу отриманню однорідних (моноспорових) культур без ознак дисоціації, з наступним виділенням найбільш життєздатних, стабільних і спороутворюючих культур.
При відборі вакцинних штамів дерматофітів кількість мікроконідій підраховували в камері Горяєва і враховували особливості морфологічних, культуральних ознак, патогенність та імуногенність.
В подальшій роботі використовували відібранні нами вакцинні штамами Trichophyton mentagrophytes 15 і Microsporum canis 22, виділені від хворих на трихофітію і мікроспорію котів відповідно. Як контрольні штами використовували Trichophyton mentagrophytes ТМ-48 К та Microsporum canis 65 К, ізольвані від хворих на трихофітію і мікроспорі