РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Загальна схема досліджень
На підставі загальноприйнятих методик щодо вивчення захворювань нами була
розроблена схема з вивчення пастерельозу кроликів:
Продовження схеми
Дослідження проводили в період з 2004 до 2008 рр. в лабораторії вивчення
бактеріальних хвороб молодняка тварин ННЦ «Інститут експериментальної і
клінічної ветеринарної медицини». Матеріал для дослідження відбирали у
господарствах Донецької, Харківської та Одеської областей. Всього було
обстежено 5 кролівницьких господарств (2 господарства у Одеській області, 2
господарства у Донецькій області, 1 господарство у Харківській області).
Епізоотичне обстеження господарств проводили шляхом аналізу та узагальнення
звітних даних з урахуванням кількості тварин, що захворіли та загинули протягом
4 років, та аналізу і узагальнення даних власних досліджень щодо серопейзажу
бактеріальної флори. У цей період проведено бактеріологічні дослідження 254
зразків патологічного матеріалу від хворих, загиблих та вимушено вбитих тварин.
З метою виділення збудника пастерельозу робили висіви слизу носових ходів,
крові серця, печінки, селезінки, легень, кісткового мозку, лімфатичних вузлів в
МПБ та на МПА, збагачені 5 - 10 % стерильної кінської сироватки крові та 2%
розчину 40 % глюкози. Висіви інкубували за температури 370С 24-48 годин. З
метою ізоляції окремих колоній пастерел використовували роздрібний висів
досліджуваного матеріалу на збагачений МПА у чашках Петрі (2-3 чашки на кожне
дослідження).
В ізольованих пастерел досліджували морфологічні, культуральні, біохімічні,
антигенні та патогенні властивості. При вивченні морфологічних властивостей
збудника пастерельозу звертали увагу на його форму, розміри, розташування у
мазках, забарвлення при фарбуванні за Грамом, Романовського-Гімза,
Буррі-Гінсом. При вивченні культуральних властивостей відмічали особливості
росту на рідких і щільних поживних середовищах та здатність утворювати S -, R -
та M - колонії. Біохімічні властивості вивчали шляхом висіву ізолятів пастерел
на малий та великий строкатий ряд середовищ Гіса. Визначали чутливість до
вуглеводів та багатоатомних спиртів, здатність штамів утворювати гази та
реагувати з деякими диференціально-діагностичними середовищами, які містять
індикатори.
Антигенні властивості штамів визначали вивчаючи серологічну належність їх у
РНГА, РДП [6, 18, 108] та за допомогою несерологічних методів з використанням
стафілококового тесту (для серологічного варіанту А) і трипофлавіну (для
серологічного варіанту Д).
Постановку РНГА здійснювали за методичними вказівками щодо діагностики,
профілактики та заходам боротьби з пастерельозом сільськогосподарських тварин
[6].
РНГА ставили у плексигласових пластинках з луночками. Готували розведення
сироваток від 1:10 до 1:1280 на 1 % розчині інактивованої нормальної кролячої
сироватки у фізіологічному розчині NaCl (рН 7,2) у об’ємі 0,5 см3 та додавали
0,05 см3 еритроцитарних діагностикумів. Облік реакції проводили через 2 години
та на слідуючу добу після інкубування за кімнатної температури. Титром
сироватки вважали останнє її розведення, у якому реакція відбувалась на 2
хрести. При постановці реакції ставили контролі: контроль на спонтанну
аглютинацію еритроцитів; еритроцитарні діагностикуми з нормальною кролячою
сироваткою; еритроцитарні діагностикуми з 1 % розчині інактивованої нормальної
кінської сироватки у фізіологічному розчині NaCl; гіперімунна сироватка з
контрольними несенсебілізованими еритроцитами у розведенні 1:2.
Типізацію культур пастерел проводили за допомогою реакції дифузної преципітації
(РДП) у плоскому агаровому гелі в чашках Петрі. Використовували 1% агар Діфко,
виготовлений на мединал-вероналовому буфері (рН 8,6) та консервований
мертіолятом у розведенні 1:10000. У реакції використовували спеціальний
семилуночковий штамп із діаметром луночок 5 мм, відстань від центральної
луночки до периферійних 8 мм. У центральну луночку вносили капсульний антиген
досліджуваного штаму, а у периферійні – гіперімунні типоспецифічні сироватки,
отримані на три серологічних типи P. multocida. Витримували компоненти реакції
у вологій камері. Облік реакції проводили через 24 та 48 годин. За наявністю
ліній преципітації визначали належність капсульних антигенів до того чи іншого
серологічного типу. В якості контролю використовували фізіологічний розчин +
гіперімунні сироватки та нормальну кролячу сироватку + антигени.
За стафілококовим тестом визначали P. multocida сероваріанту А. Для цього в
чашку Петрі з МПА висівали дослідну культуру пастерел шляхом штриховки
(відстань між штрихами 1-2 мм), а перпендикулярно до цих штрихів висівали таким
же методом культуру стафілококу. У місцях перехрещення двох культур у разі
позитивної реакції повинні утворюватись зони просвітлення (гіалуронідаза
стафілокока руйнує гіалуронову кислоту, яку утворюють пастерели).
Для визначення пастерел серологічного варіанту Д використовували розчин
трипофлавіну 1:1000, а в якості контролю референтні штами пастерел серологічних
варіантів А, В, Д. Досліджувану культуру пастерел висівали у центрифужні
пробірки з бульйоном Хоттінгера, що вміщував 10% нормальної кінської сироватки.
Інкубували за температури 370С 24 години. Далі центрифугували 30 хвилин (1000
об/хв), видаляли надосад. Осад ресуспендували. У кожну пробірку вносили по 0,5
см3 розчину трипофлавіну, перемішували та витримували за кімнатної температури
протягом 30 хвилин. Культура пастерел, яка відноситься до серологічного
варіанту Д, утворювала з трипофлавіном стійкий фло