РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Диссертационная работа выполнена в период с 1999 по 2003г.г. в лаборатории изучения туберкулеза Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины Украинской академии аграрных наук и Сумской государственной биофабрике.
Бактериологическое исследование патологоанатомического материала, отобранного от крупного рогатого скота и птиц, проводили в соответствии с "Наставлением по диагностике туберкулеза животных и птиц", утвержденным Главным государственным инспектором ветеринарной медицины Украины в 1994 году.
Культуральному исследованию подвергнут биоматериал, отобранный от 12 кур, 1 индейки, 35 проб крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин из благополучных по туберкулезу хозяйств расположенных в зоне Степи, Лесостепи и Полесья Украины.
Предпосевную обработку каждого патологического материала проводили по методу А.П. Аликаевой (1940) и высевали на 10 пробирок с яичной питательной средой для культивирования микобактерий [253].
У первично выделенных нами 11 культур микобактерий, а также полученных путем селекции 6 культур изучали морфологию колоний, тинкториальные свойства по методу окраски Циль-Нильсена, скорость и характер роста колоний на яичных питательных средах при температурах 25, 37 и 45оС. Определяли фотохромогенность (G. Kubica, 1973), а также каталазную (С. Middlebrook, 1954), амидазную активность (A.Taegnet et al., 1964) в модификации Т.Б. Ильиной (1981), реакцию с туллуритом калия (J. Kielburn et al, 1969), гидролиз Твин-80 (G. Wayne, 1962), устойчивость к 5% хлористому натрию (D. Kestle, 1967), а также рост на мясопептонном бульоне и по результатам полученных данных, с учетом биологических свойств, определяли видовую принадлежность выделенных культур микобактерий [44, 45, 47, 48, 340, 341].
Патогенные свойства у выделенных из патологического материала культур микобактерий и полученных путем селекции (6 культур) изучали в опытах на морских свинках, кроликах и курах.
При определении видовой принадлежности культур микобактерий были использованы в качестве контроля референтные штаммы микобактерий M.bovis (шт. Vallae), M.avium, M.terrae, M.triviale, M. nonchromogenicum, находящиеся в коллекции лаборатории изучения туберкулеза Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН.
Селекцию выделенных культур микобактерий птичьего вида проводили путем четырехкратного посева на яичную питательную среду для культивирования микобактерий в разведениях от 10-1 до 10-6.
Тинкториальные свойства у культур микобактерий исследовали путем микроскопии мазков окрашенных по методу Циль-Нильсена, морфологические свойства культур микобактерий изучали после посева на плотную яичную питательную среду.
Из питательных сред для проведения исследований были использованы:
- картофельно-глицериновая среда Павловского,
- сухая питательная среда для культивирования микобактерий,
- среда Сотона,
- синтетическая питательная среда ЗКП-1,
- синтетическая питательная среда ЗКП-1 с парафиновыми дисками,
- картофельный отвар,
- синтетическая питательная среда ЗКП-1 с картофельным отваром в соотношении (1:2).
Накопление бактериальной массы в 1 литре синтетической питательной среды определяли путем взвешивания ее на аналитических весах.
Содержание белка в культуральном фильтрате определяли после осаждения 50% трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и переосаждения насыщенным раствором сернокислого аммония по методу Къельдаля [342].
При определении специфичности, активности и сенсибилизирующих свойств изготовленных серий туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном растворе в качестве контроля использовали "Сухой очищенный туберкулин (ППД) для птиц" (серия 12, госконтроль 12, изготовленный 30.11.2002г.), "Растворитель микобактериальных аллергенов" (серия 14, госконтроль 14, изготовленный 25.05.98г.) производства Курской биофабрики (Россия).
Для сенсибилизации морских свинок, а также кур использовали производственный штамм культуры микобактерий птичьего вида M.avium ИЭКВМ УААН.
При выполнении работы были приготовлены и испытаны 3 серии "Туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном растворе в лаборатории изучения туберкулеза ИЭКВМ УААН и 5 серий этого аллергена по разработанной нами схеме на Сумской биофабрике.
В каждой серии приготовленного туберкулина очищенного (ППД) для птиц в стандартном растворе определяли следующие показатели:
- Внешний вид, визуально просматривали каждый флакон с туберкулином на наличие механических примесей, плесени, целостности флакона и его укупорку.
- Однородность, устанавливали путем просмотра флаконов в проходящем свете.
- Стерильность, из каждой серии изготовленного туберкулина отбирали по три флакона, содержимое которых смешивали и высевали по 0,2-0,3 см3 в пробирки с мясопептонным агаром (МПА), мясопептонно-печеночным бульоном (МППБ), средой Китта-Роцци, средой Сабуро и во флаконы с мясопептонным бульоном (МПБ), по три пробирки (флаконы) каждой среды. Пробирки с посевами инкубировали в термостате при температуре 37оС, а на среде Сабура - при 22оС. Учет роста посевов проводили в течение 14-21 дня.
- Безвредность изучали в опытах на 60 белых мышах массой 18-20 г, которым вводили подкожно 0,25 см3 стерильного туберкулина. Аллерген считали безвредным, если все животные оставались живыми в течение 10 дней, и на месте введения препарата не было воспалительных реакций.
- Сенсибилизирующие свойства каждой изготовленной серии туберкулина изучали в опытах на 6 здоровых морских свинках, не реагировавших на туберкулин и не использованных ранее ни в каких опытах. С этой целью трем свинкам внутрикожно вводили по 500 ТЕ аллергена в объеме 0,1 см3 трехкратно, с интервалом 5 суток. Через 15 суток, после последней инъекции, трем морским свинкам, получившим три инъекции туберкулина и трем контрольным, вводили внутрикожно по 500 ТЕ препарата в объеме 0,1 см3. Осмот