РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМІВ ДОСЛІДЖЕНЬ
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
Робота виконувалась упродовж 2000–2005 рр. у науково-дослідній лабораторії
кафедри мікробіології та вірусології Білоцерківського державного аграрного
університету.
Матеріалом мікологічних досліджень були 90 проб зерна кукурудзи, відібраних у
2000–2002 рр. в колгоспах, агрофірмах та приватних підприємствах із 10 областей
України: Київської, Вінницької, Житомирської, Кіровоградської, Херсонської,
Одеської, Харківської, Миколаївської, Дніпропетровської та Донецької в період
зберігання. Зразки середніх проб відбирали відповідно до діючих державних
стандартів (ГОСТ 13586, 3–83). З метою проведення діагностичних досліджень із
зерна кукурудзи сумнівної якості відбирали проби із місць з найбільш вираженими
ознаками ураження.
Виділено та ідентифіковано за видовою приналежністю 527 культур грибів,
токсикологічно досліджено 64 культури грибів роду Fusarium та 169 культур роду
Aspergillus.
2.1. Методи мікологічних досліджень
Для виявлення загальної мікобіоти використовували метод прямої інокуляції.
Зерно висівали в чотири чашки Петрі з середовищем Чапека, розкладаючи їх по 10
штук пінцетом на поверхні середовища в кожну чашку. З метою виявлення глибинної
мікобіоти зерно протравлювали 3-відсотковим розчином формаліну і промивали
стерильною водою, ділили надвоє і розкладали в чотири чашки Петрі з середовищем
Чапека по 10 штук. Посіви культивували в двох чашках відповідно при 24 та 37 °С
протягом тижня. Для отримання чистих культур, починаючи з 3-го дня росту, гриби
відсівали на скошене середовище Чапека.
З метою вивчення кількісного складу мікобіоти зерно подрібнювали і готували
серійні розведення. Для цього наважку подрібненого зерна масою 10 г заливали до
100 мл стерильною водою і струшували протягом 15–20 хвилин. Із отриманого
розведення готували послідовні розведення в пробірках 1:100, 1:1000 та 1:10000,
з яких у стерильні чашки Петрі вносили по 1 мл суспензії, заливали 15 мл
розплавленого і охолодженого до 45 °С агару Чапека і перемішували коловими
рухами. Кожне розведення висівали в 4 чашки і по дві інкубували при 24 та 37
°С. На 3–5-й день росту проводили підрахунок кількості колоній грибів та
визначали вміст діаспор грибів в одному грамі корму. Статистичну обробку
отриманих результатів проводили за І.А. Ашмаріним і А.А. Ворбйовим (1962),
використовуючи формули:
де С – вміст діаспор грибів в одному грамі корму; Km, K1, K2 і т. д. –
знаменники максимального і використаних розведень, починаючи з мінімального; V
– об’єм висіяної суміші (мл); N, N1, N2, і т. д. – кількість діаспор, спочатку
середнє, а потім – в кожному розведенні.
Ідентифікацію виділених грибів проводили за допомогою визначників грибів Н.М.
Підоплічка [79, 80, 81], В.И. Билай [11]. Для видової ідентифікації грибів роду
Fusarium, що не утворювали конідій, застосовували метод мікрокультури [13]. В
основі методу використаний принцип швидкого виснаження джерел живлення при
наявності оптимальної вологості повітря та температури. Користуючись
розробленим методом мікроскопічної культури для Fusarium, можна отримати через
24–72 год типове спороношення у різних видів та прослідити цикл їх розвитку –
від проростання до утворення конідій.
На внутрішню сторону верхньої кришки стерильної чашки Петрі піпеткою наносять
ряди крапель рідкого середовища Чапека на відстані до 2 см один від одного. Дно
нижньої чашки накривають 1–3 шарами фільтрувального паперу і зволожують цого
2–3 мл дистильованою стерильною водою, не допускаючи надлишкового зволоження, а
тільки змочуючи його. Середовище інокулюють конідіями перед нанесенням крапель,
при відсутності спороношення. Крапли інокулюють за допомогою мікологічного
крючка. Потім чашкою з фільтрувальним папером накривають кришку з
інокульованими краплями поживного середовища і ставлять в термостат при
температурі 28 °С. При вивченні різних факторів в мікокультурі краплі на кришці
помічають яким-небудь методом і ці дані записують в журнал. У культур, що
утворюють конідії на сусло-агарі, через 20–24 год з’являлись нові типові та
надлишкові макроконідії. У аспорогенних культур процес утворення макроконідій
проходив дещо повільніше. Перші макроконідії з’являлися через 72 год з моменту
посіву культури, а у видів, що характеризуються надлишковим утворенням
мікроконідій – через 24–48 год.
Таким чином, при вивченні значної кількості штамів ріного походження та
тривалості зберігання багатьох видів фузаріїв як аспорогенних, так і володіючих
здатністю утворювати типові макроконідії на 10–15 добу при культивуванні в
мікрокультурі спостерігалося надлишкове спороношення.
Отримані дані дозволяють рахувати цей експрес-метод придатним для отримання
типового спороутворення, особливо при ідентифікації видів. Розміри конідій і
міцелію грибів визначали за допомогою окуляр-мікрометра при мікроскопії
роздавленої краплі в сухій системі, а в деяких випадках під імерсією.
Визначення видової належності виділених грибів роду Fusarium проводили у
відділі фізіології та систематики мікроміцетів Інституту мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за участю кандидатів біологічних
наук І.О. Еланської та О.В. Соколової, яким автор висловлює щиру подяку.
2.2. Методи мікотоксикологічних досліджень
Токсичність 64 штамів грибів роду Fusarium досліджували мікробіологічним
методом (Рухляда В.В., Башмакова Е.В., 1988), який базується на встановленні
пригнічення росту чутливого тест-мікроорганізму – Candida pseudotropicalis штам
44 ПК токсином грибів. Використовували два варіанти: метод паперових дисків та
агарових блоків. У першому варіанті культуру досліджуваного гриб
- Київ+380960830922