РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти дослідження
Об'єктами дослідження були:
- штами Streptomyces avermitilis (Burg et al. 1979) Kim et Goodfellow 2002:
* УКМ Ас-2161, виділений з чорнозему мало гумусному Попельнянського району Житомирської області України [96];
* УКМ Ас-2172 - варіант 228, отриманий в результаті селекції S. avermitilis УКМ Ас-2161 з використанням спонтанної мінливості та ультрафіолетових променів [101];
* УКМ Ас-2179 - варіант, отриманий в результаті селекції S. avermitilis УКМ Ас-2172 з використанням N-метил-N?-нітро-N-нітрозогуанідину [98, 103];
* рифампіцин резистентні варіанти [11];
- комплексний препарат аверком, отриманий з міцелію 7-добової культури Streptomyces avermitilis УКМ Ас-2179.
- тест-культури мікроорганізмів для вивчення антибіотичної дії:
- референтні штами отримані з колекції антибіотиків: Staphylococcus aureus 209, Escherichia coli 028, Proteus vulgaris u-8, Bacillus subtilis BKM 501, Candida albicans 690;
- азотфіксувальні та фосфатмобілізувальні бактерії отримані з колекції відділу загальної і грунтової мікробіології ІМВ НАНУ: Bacillus megaterium УКМ В-5724 , Azotobacter chroococcum К (еталонний штам ),
Azotobacter chroococcum УКМ В-6003, Rizobium legominosarum УКМ В-6068, Rizobium meliloti УКМ В-6076;
- фітопатогенні бактерії, отримані з колекції відділу фітопатогенних бактерій ІМВ НАНУ: Pseudomonas syringae pv. atrafaciens 912 - збудник базального бактеріозу пшениці; Pseudomonas syringae pv. coronafaciens 9030 - збудник ореольного бактеріозу вівса; Pseudomonas syringae pv. panici 7979 - проса; Pseudomonas syringae pv. holci 8300 - сорго; Pseudomonas savastanoi pv. glycinea 8541 - сої; Pseudomonas savastanoi pv. phaseolicola 7838 - квасолі; Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli 8562 - сої; Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 7749, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 7754, Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus 7757 - картоплі;
- фітопатогенні гриби, отримані з колекції відділу фізіології і систематики мікроміцетів: Alternaria alternata k.36 - збудник чорного зародку та плямистості листя озимої пшениці; Fusarium оxysporum n.33 - кореневої гнилі гороху; Fusarium sambucinum var. minus 00143 ZQS - сухої гнилі картоплі; Botrytis cinerea k. 35 - сирої гнилі злаків; Verticillium lateritium 00142 ZQS - сухої гнилі клубнів; Trichothecium rjzeum 00096 ZQS - кагатної гнилі та плісняви насіння ячменю; Cladosporium herbarum n.34 - оливкової плісняви злаків; Cylindrocarpon destructans 00617 ZQS - гнилі картоплі при зберіганні.
- мікробні угруповання чорноземного ґрунту.
- нематоди:
? галові нематоди Meloidogyne incognita для визначення нематоцидної дії;
? аборигенні популяції фітонематод: Ditylenchus dipsaci (стеблова), Pratylenchus pratensis, Tylenchobrynchus dubius, Helicotylenchus dihystera, Paratylenchus nanus наявні у чорноземному ґрунті наданому нам керівництвом Приватного Інституту Radostim (Німеччина).
- аверсектин С - стандартний розчин авермектинів для хроматографії виробництва
НВО "Фармбіомед".
- івермектин - хімічно модифікований авермектин В1, який містить не
менше 80% 22,23-дигідроавермектина В1а та не більше 22,23-дигідроавермектина В1б, фірми "Merck" (США).
- регулятори росту рослин, розроблені в Інституті біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України у Міжвідомчому науково-технологічному центрі "Агробіотех" НАН і МОН України [129]:
? емістим С - продукт біосинтезу гриба Cylindrocarpon destructans Scholter var. destructans (Zins), виділеного з ризосфери женьшеню; являє собою комплекс ростових речовин, аналогів фітогормонів ауксинової та цитокінінової дії, ненасичених жирних кислот, амінокислот, мікроелементів (К+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Cu2+ PO43-, SO42);
? агроемістим-екстра (торгова марка біолан) - удосконалений аналог емістиму С, який характеризується підвищеним вмістом, поліненасичених жирних кислот, що відповідають за вироблення фітонцидів, фітоалексинів і хелатних форм біогенних мікроелементів.
- насіння і рослини сільськогосподарських культур: редис (Raphanos sativus L.) сорту Червоний з білим кінчиком, пшениця (Triticum aestivus L.) озима сортів Поліська, Крижинка і яра сорту Колективна 3, огірки (Cucumis sativus L.) сорту Анжеліна та Родничок.
2.2. Умови культивування мікроорганізмів
Стрептоміцети вирощували на агаризованих середовищах або у рідких середовищах (глибинним способам). У першому випадку використовували чашки Петрі чи пробірки (по 20 мл середовища у кожну) або скляні плоскі флакони ("матраци") об'ємом 1,5 л (по 150 мл середовища). У другому випадку культури вирощували на роторних качалках (n = 240 об/хв) у скляних колбах об'ємом 750 мл; середовища розливали по 50 мл у 1 колбу. Культивування проводили при температурі +28 ± 1оС. Тривалість вирощування складала 1 - 10 діб в залежності від мети досліду. Посівний матеріал (маточна культура) вирощували впродовж доби і засівали ферментаційне середовище у кількості 5%/V.
Склад агаризованих середовищ для вирощування стрептоміцетів (г/л):
ISP-3 - вівсяні пластівці 20; розчин мікроелементів (FeSO4·7H2O - 0,1; MnCl2·4H2O - 0,1; ZnSO4·7H2O - 0,1 в 100 см3 дистильованої води) 1 мл; агар - 18; дистильована вода 1 л; рН 7,2. Вівсяні пластівці заливали гарячою водою на 10 год, доводили до кипіння, відфільтровували через кілька шарів марлі, з'єднували з розплавленим у воді агаром і доводили до 1 л [256];
агар Гаузе № 1 (Г-1): KNO3 - 1; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,5; NaCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; крохмаль розчинний 20; агар 15-20; водогінна вода 1 л; pH 7,2-7,4 [20];
агар Гаузе № 2 (Г-2): бульйон Хотінгера (700 мг % амінного азоту) 30 мл; пептон - 5; NaCl - 5; глюкоза - 10; агар - 15-20; водогінна вода 1л ; pH 7,0-7,2 [20];
глюкозо- картопляний агар (ГКА): очищена картопля - 200; глюкоза - 20; СаСО3 - 0,2; MgSO4·7 Н2О - 0,2; агар - 15; водогінна або дистильована вода 1л; рН 6,8-7,2 [265];
крохмалево-аміачний агар (КАА): крохмаль розчинний - 10; K2HPO4 - 1