РОЗДІЛ 2
ВИДІЛЕННЯ КОМПЛЕКСІВ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН З КВІТОК, ЛИСТЯ БУЗИНИ ЧОРНОЇ ТА ЛИСТЯ БУЗИНИ ТРАВ'ЯНИСТОЇ
2.1. Короткі відомості про прилади, методи і реактиви
Для хроматографування застосовували різні марки паперу "Filtrak" (FN 1,3,7,14), а також пластинки "Silufol UV-254", "Silufol UV-366" (Чехія) та "Sorbfil"-ПТСХ-А-УФ.
Для досліджень використовували метод висхідної і низхідної одномірної, двомірної і багаторазової ПХ та ТШХ. Результати значення Rf на хроматограмах є середніми величинами 5-6 визначень.
1. Розчинники для приготування хроматографічних систем використовували кваліфікації ч.д.а. або х.ч.; співвідношення розчинників, позначені цифрами, взяті в об'ємних одиницях. Для хроматографування використовували наступні системи розчинників:
№ 1 - н-бутанол-кислота оцтова-вода БОВ (4:1:2);
№ 2 - 2 % кислота оцтова;
№ 3 - 15 % кислота оцтова;
№ 4 - хлороформ (формамід 25 %);
№ 5 - хлороформ-кислота оцтова-вода (13:6:2);
№ 6 - етилацетат-кислота оцтова-кислота мурашина-вода (100:11:11:25);
№ 7 - етилацетат-кислота мурашина-вода (3:1:1);
№ 8 - ацетон-н-бутанол-вода (7:2:1);
№ 9 - 5 % кислота оцтова;
№ 10 - 1 % кислота хлоридна;
№ 11 - гексан-ацетон (8:4);
№ 12 - гексан-ацетон (8:2);
№ 13 - гексан-ацетон (6:2);
№ 14 - гексан-ацетон (6:4);
№ 15 - хлороформ-метанол (9:1);
№ 16 - гексан (формамід 25 %)
№ 17 - бензол-етилацетат-ацетон (100:8:0,5);
№ 18 - хлороформ-метанол-вода (65:25:4).
2. На хроматограмах речовини виявляли до і після обробки різними реактивами за забарвленням у денному світлі та за флуоресценцією їх у фільтрованому УФ-світлі:
А - 3 % розчином заліза (III) хлориду;
Б - діазореактивом;
В - парами аміаку;
Д - 10 % спиртовим розчином натрію гідроксиду;
Е - анілінфталатним реактивом (0,33 г аніліну та 1,66 г кислоти фталевої в 100 мл н-бутанолу, насиченого водою);
Ж - 0,1 % розчином нінгідрину в етанолі;
З - 10 % розчином кислоти сірчаної;
К - 20 % розчином кислоти сірчаної;
Л - 1 % спиртовим розчином алюмінію хлориду;
М - 5 % спиртовим розчином алюмінію хлориду;
Н - реактивом Бартона (рівні об'єми 0,1 % розчинів хлориду окисного заліза (III) і калія ферриціаніду);
П - 1 % розчином ваніліну в кислоті сірчаній концентрованій;
Р - 10 % розчином кислоти фосфорновольфрамової;
С - реактивом Шталя;
Т - розчином бромфенолового синього і метилового червоного (0,3 г бромфенолового синього і 0,1 г метилового червоного в 100 мл метанолу).
3. Для хроматографічного розділення речовин, що досліджували, використовували целюлозу (фракція 0,25-0,5 мм), силікагель марки КСК з розміром часток від 0,25 до 0,75 мм, марки LS 100/250 і порошок поліамідного сорбенту з розміром часток від 0,25до 0,75 мм.
4. Речовини аналізували після двох-, трикратної кристалізації з відповідних розчинників і висушуванні у вакуумі при 10-2 мм рт. ст. над фосфорним ангідридом протягом 4 год при 110 - 115°С.
5. Температуру плавлення визначали на блоці Кофлера.
6. УФ-спектри поглинання знімали на спектрофотометрах СФ-46 і "Specord UV-Vis" у кюветах з товщиною шару 10 мм при концентрації речовин 1-2?10-3.
7. ІЧ-спектри знімали на спектрометрі UR-20 (Німеччина) в таблетках калію броміду 1 мм заввишки при співвідношенні речовини і наповнювача 1:200-1:400.
8. Оптичну активність глікозидів вимірювали на поляриметрі СПУ-Е.
9. Якісний склад і кількісний вміст амінокислот визначали на амінокислотному аналізаторі LKB 4151 "Альфа Плюс" (Швеція) на колонці, заповненій іонообмінною смолою марки DCGA.
10. Жирнокислотний склад ліпофільного комплексу визначали на хроматографі "Crom-5".
11. Визначення елементного складу проводили на спектрофотометрі С-115М і приладі ФПА-1.
12. Дослідження ліпофільного екстракту проводили за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в УФ-світлі та видимому діапазонах спектру, використовуючи спектрофлуориметр Hitachi F 4010.
13. Мікропрепарати для вивчення анатомічної будови готували зі свіжозібраної, фіксованої в суміші спирт - гліцерин - вода (1:1:1) сировини; вивчали під мікроскопами МБР-1 і при збільшенні в 80, 200 і 400 разів. Діагностичні ознаки фотографували фотоапаратом "ФЕД-5" на плівку "Мікрат-200".
14. Фармакологічні дослідження 40% настойок проводили in vivo та in vitro.
2.2. Дослідження якісного складу біологічно активних речовин
Об'єктами досліджень були квітки і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої. Сировина була заготовлена в 2004-2005 роках у Харківському, Дергачівському, Зміївському, Вовчанському, Балакліївському районах Харківської області України.
Для встановлення якісного складу використовували загальноприйняті методи досліджень - якісні реакції, ПХ, ТШХ [100,104,105].
Для приготування водних екстрактів 50,0 г подрібненої сировини, що проходить крізь сито з діаметром отворів 2-3 мм, заливали водою 1:5 і нагрівали зі зворотним холодильником на киплячому водяному огрівнику протягом 1 год, періодично збовтуючи для змивання часток сировини зі стінок. Отриману гарячу витяжку фільтрували через складчастий фільтр. Екстракцію сировини повторювали ще двічі в описаних вище умовах новими порціями екстрагенту. Об'єднаний екстракт концентрували у вакуумі до 50 мл і використовували для визначення вуглеводів, амінокислот, дубильних речовин, гідроксикоричних кислот, органічних кислот [102].
Водно-спиртові екстракти отримували за методикою, описаною вище. Екстракцію 50,0 г сировини проводили 70% спиртом етиловим. Водно-спиртову витяжку використовували для визначення флавоноїдів, сапонінів [60,102].
Для проведення якісних реакцій на антоціани 10,0 г сировини екстрагували 10 мл 1% спиртового розчину кислоти хлоридної і нагрівали на киплячому водяному огрівнику протягом 15 хв, періодично збовтуючи для змивання часток сировини зі стінок. Витяжки охолоджували, фільтрували, з фільтратом проводили якісні реакції на антоціани [5,6].
- Київ+380960830922