РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1.Обгрунтування та завдання досліджень
Враховуючи дані літератури ми поставили перед собою завдання вивчити дію цезієвого і стронцієвого отруєння на стан обмінних процесів у клітинах тканин щурів. Для цього необхідно дослідити стан ферментних систем гліколізу та ЦТК, вміст їх окремих субстратів, вміст продуктів азотного обміну, КЛС крові отруєних тварин та вміст окремих макроелементів, а також вивчити вплив змін КЛС крові щурів на інтенсивність накопичення та виведення вказаних важких металів.
Для досягнення поставленої мети було заплановано проведення досліджень, в яких ставилося завдання визначити вміст і розподіл цезію та стронцію в органах отруєних щурів; провести вивчення стану основних обмінних процесів організму щурів, отруєних хлоридами цезію та стронцію (гліколізу, циклу трикарбонових кислот); провести дослідження окремих біохімічних показників крові та печінки щурів за умов цезієвого та стронцієвого отруєння; сконцентрувати увагу на виясненні молекулярних механізмів виникнення токсичних явищ при дії солей цезію і стронцію; визначити інтенсивність накопичення солей цезію і стронцію в органах отруєних щурів в умовах зміни кислотно-лужного стану; визначити інтенсивність виведення солей цезію і стронцію з органів отруєних щурів за умов експериментального метаболічного ацидозу.
2.2. Модель досліду
Особливості обмінних процесів у організмі тварин, отруєних хлоридами цезію та стронцію викликають значну наукову цікавість. Вивчення метаболічних процесів, перш за все змін показників КЛС крові, електролітного балансу, вуглеводного і азотного обмінів, активності ферментів дає можливість не тільки встановити взаємозв'язок між цими процесами, а й виявити механізми регуляції їх порушення.
Для виконання поставлених завдань по визначенню біохімічних показників обміну в організмі тварин за умов введення солей цезію та стронцію, щурів штучно отруювали хлоридами відповідних металів.
Дослідження виконували в науковій проблемній лабораторії кафедри біохімії тварин, якості і безпеки сільськогосподарської продукції імені акад. М.Ф. Гулого НАУ, в віварії факультету ветеринарної медицини, Українській лабораторії якості і безпеки продукції АПК, а також у відділі регуляції обміну речовин Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України. Для цього використали клінічно здорових самців білих лабораторних щурів 3-місячного віку, масою тіла 150 - 200 г, яких утримували в віварії на стандартному раціоні в клітках по 6 голів. Під час експерименту використано 240 тварин.
Отруєння щурів проводили впродовж 14 діб, шляхом щоденного внутрішньочеревного введення цезію та стронцію хлоридів у дозі 1/15 , із розрахунку 0,006 г стронцію хлориду або 0,01 г цезію хлориду на 0,1 кг маси тіла. З метою моделювання стану метаболічного ацидозу та алкалозу щурам дослідних груп per os уводили 2 %-ний розчини HCl ? 4 мг на 0,01 кг маси тіла та NaHCO3 ? 5 мг на 0,01 кг маси тіла.
Піддослідних тварин розділили на 9 груп по 8 особин у кожній. Досліди проводили згідно зі схемою:
I ? інтактні щури (контроль);
II ? щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид;
ІІІ ? щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням НСl;
ІV ? щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид з одночасним застосуванням розчину NaHCO3;
V ? щури, яким упродовж 14 діб вводили цезію хлорид, після чого впродовж 20 діб вводили розчин НСl;
VI ? щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид;
VII ? щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину НСl;
VIII ? щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид з одночасним введенням розчину NaHCO3;
IX ? щури, яким упродовж 14 діб вводили стронцію хлорид, після чого впродовж 20 діб ? розчин НСl.
Для проведення біохімічних досліджень від щурів відбирали зразки печінки, нирок, серця, кісток, м'язів та крові.
Експерименти проводили відповідно до конвенції Ради Європи щодо захисту хребетних тварин, яких використовують в наукових цілях.
2.3.Матеріали досліджень
2.3.1. Визначення вмісту металів в тканинах та органах
Визначення вмісту металів проводили в наступних органах: м'язах, печінці, нирках, серці, кістках. Органи відбирали відразу після декапітації, зважували та висушували до повітряно сухої маси. Висушені зразки органів озолювали в муфельній печі, при поступовому доведенні температури до . Після охолодження, золу розчиняли нітратною кислотою та розводили одержаний розчин бідистилятом до об'єму 5 мл [19,132].
2.3.2. Визначення активності ферментів
Для визначення активності ферментів ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41), малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37) і лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27) викорис-товували цитозольну фракцію печінки, яку отримували методом диференційного центрифугування гомогенату печінки у 0,25М сахарозі, що містить 6мМ ЕДТА при 105000?g протягом 60 хв. Для визначення активності аспартатамінотрансферази (КФ2.6.1.1) і аланінамінотрансферази (КФ 2.6.1.2) використовували центрифугат свіжевідібраної крові [4,52,82,83,95].
2.3.3. Визначення вмісту інтермедіатів гліколізу та ЦТК
Визначення вмісту інтермедіатів гліколізу та ЦТК виконували у печінці щурів. Для цього печінку вилучали негайно, після декапітації, розтирали її у рідкому азоті. З розтертої маси готували безбілкові екстракти в 6% хлорній кислоті у відношенні 1:7. Екстракт нейтралізували насиченим розчином КОН, після чого в ньому визначали концентрацію ізоцитрату, малату, лактату, пірувату, глутамату, ?-кетоглутарату і оксалоацетату [4,52,82,83].
2.3.4. Визначення величини співвідношень НАД+/НАДН та НАДФ /НАДФН
Величину співвідношень НАД+/НАДН і НАДФ/НАДФН у цитозолі та мітохондріях клітин розраховували за кількістю і співвідношенням інтермедіатів лактатдегідрогеназної, малатдегідрогеназної (декарбоксилюючої), ізоцитрат-дегідрогеназної та глутаматдегідрогеназної реакцій за номограмни