РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти, етапи та умови проведення експерименту
Експериментальні дослідження, проведені на безпородних статевозрілих білих щурах-самцях, масою 200-250 г. Тварин утримували на стандартному раціоні віварію. Наші дослідження проводилися в осінньо-зимовий період, беручи до уваги той факт, що показники імунної системи змінюються у відповідності до сезону. Всього в експерименті було задіяно 200 тварин.
У даній роботі нами використана класична модель хронічного гіперімунокомплексного процесу, запропонована Cochrane G., Коffer D [187]., у модифікації C. В. Willson et al [202] та посилання на праці попередніх досліджень Чоп'як В.В. [162].
Відомо, що багаторазове введення в організм розчинного антигену призводить до утворення циркулюючих імунних комплексів, які шляхом фіксації у мікроциркуляторному руслі викликають активацію комплементу, що спричиняє ряд каскадних міжклітинних взаємодій, результатом чого є персистенція запалення, причому клітинний субстрат запалення регулюється аутокринно, паракринно і міжсистемно.
Для відтворення моделі ХГІК тваринам вводили один раз в тиждень у хвостову вену бичачий сироватковий альбумін (БСА) з розрахунку 100 мг/кг маси впродовж 12 тижнів. ХГІК супроводжується збільшенням рівня ЦІК у крові. За рівнем ЦІК оцінювали розвиток хвороби.
Усі експериментальні тварини були поділені на 4 серії:
І серія - інтактні тварини, яким у хвостову вену кожні 7 днів впродовж 12 тижнів вводили фізіологічний розчин із розрахунку 100 мг/кг (50 тварин);
II серія - тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, яким у хвостову вену кожні 7 днів впродовж 12 тижнів вводили бичачий сироватковий альбумін із розрахунку 100 мг/кг (50 тварин).
IIІ серія - інтактні тварини, яким вводили корвітин внутрішньоочеревинно в дозі 40 мг/кг маси тіла щура впродовж 10 днів (50 тварин);
IV серія - тварини із змодельованою і верифікованою лабораторними дослідженнями хронічною гіперімунокомплексемією, яким вводили внутрішньоочеревинно корвітин у дозі 40 мг/кг маси тіла щура впродовж 10 днів (50 тварин);
Дослідження in vitro проводилось у 8 серіях суспензії клітин лімфоцитів та ендотеліоцитів:
I серія - лімфоцити інтактних тварин, інкубовані без ендотеліоцитів (сумарно 20 тварин);
II серія - ендотеліоцити інтактних тварин, інкубовані без лімфоцитів (сумарно 20 тварин);
III серія - сумісна інкубація лімфоцитів та ендотеліоцитів інтактних тварин (сумарно 20 тварин);
IV серія - сумісна інкубація лімфоцитів та ендотеліоцитів інтактних тварин у присутності корвітину (сумарно 20 тварин);
V серія - лімфоцити тварин із змодельованою ХПК, інкубовані без ендотелію (сумарно 20 тварин);
VI серія - ендотеліоцити тварин із змодельованою ХПК, інкубовані без лімфоцитів (сумарно 20 тварин);
VII серія - сумісна інкубація лімфоцитів та ендотеліоцитів тварин із змодельованою ХПК (сумарно 20 тварин);
VIII серія - сумісна інкубація лімфоцитів та ендотеліоцитів тварин із змодельованою ХПК в присутності корвітину (сумарно 20 тварин);
Тест-об'єктами наших досліджень служили лімфоцити периферичної
крові щурів та ендотеліоцити черевної аорти. В усіх групах проведені дослідження показників синтазного та аргіназного шляху метаболізму оксиду азоту. Паралельно із дослідженнями, методом електронної мікроскопії, вивчались ультраструктурні зміни у лімфоцитах периферичної крові та
ендотеліоцитах черевного відділу аорти тварин.
Для проведення експериментів in vitro були використані лімфоцити периферичної крові і ендотеліальні клітини черевного відділу аорти білих щурів.
Отримані лімфоцити відмивали фізіологічним розчином і ресуспендували до робочих концентрацій (3•106/мл) у 199 середовищі із 10% вмістом телячої ембріональної сироватки. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою 0,1% розчину трипанового синього. Виділені ендотеліоцити відмивали 199 середовищем і доводили до концентрації 3•106 в 1 мл у повному поживному середовищі. Клітини для інкубування підраховували в камері Горяєва.
Інкубацію лімфоцитів крові з ендотеліальними клітинами проводили в 24-лункових планшетах для культуральних досліджень в середовищі, яке складалося з 199 середовища та ембріональної телячої сироватки (20%). Клітини розділяли напівпроникними мембранами з діаметром пор 3 ?М, що дозволяло запобігти змішуванню клітин.
У кожну лунку планшети вносили по 200 мкл суспензії ендотеліоцитів (3-10б/мл) та лімфоцитів у співвідношенні 1:1. Клітини інкубували в термостаті при 37°С в атмосфері з 5% СО2 впродовж 1 год. При таких співвідношеннях і в умовах інкубування культура різних популяцій клітин є доброю моделлю для вивчення кооперативної взаємодії між цими клітинами, оскільки їх життєздатність становить від 83 до 96%.
Для з'ясування впливу корвітину на функціональну активність лімфоцитів та ендотеліоцитів інтактних тварин та тварин із змодельованою ХГІК у лунку планшети вносили по 200 мкл розчину корвітину в дозі 1•104/мл г/л.
Після інкубації у досліджуваних клітинах проводили визначення активності синтаз оксиду азоту, рівень стабільних метаболітів NO, вміст нітрозоглутатіону (GSNO), активність аргінази та сечовини.
Препарат корвітин розроблений в Україні (Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика та Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця і) і освоєний Борщагівським фармацевтичним заводом. Доза препарату складала 40 мг на кг маси тіла тварини, який вводили доочеревинно 1 раз на добу, курсом 10 днів. Підбираючи дозу препарату керувались даними літератури [52, 88].
Визначення досліджуваних показників проводили на 92 день від початку введення бичачого альбуміну і на 11 день від початку введення корвітину. Контрольним групам тварин вводили плацебо. Евтаназію тварин проводили шляхом декапітації з дотриманням Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985).
2.2.