ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материал исследования
Клеточные культуры HeLa поддерживали на среде RPMI 1640 с добавлением 10 % сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков при 37?С и в присутствии 5 % двуокиси углерода в атмосфере [75].
Эпителиоциты получали путём влагалищных лаважей от 15 здоровых женщин-добровольцев во время профилактических осмотров, проводимых в поликлинике № 10 г. Луганска с соблюдением положений биоэтики (Страсбург, 1985 год). Во влагалище вводили стерильное гинекологическое зеркало, а затем с помощью стерильной пипетки, соединённой с 10-миллилитровым одноразовым шприцем, проводили лаваж 5 мл стерильного фосфатно-буферного раствора в течение 30 секунд. Жидкость собирали в стерильную пробирку, центрифугировали в течение 10 минут при 800 g и удаляли супернатант. Оставшиеся клетки ресуспендировали и использовали либо немедленно, либо помещали их в раствор для криогенной заморозки, состоящий из 50 % фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 35 % среды RPMI 1640 (Gibco, США) и 15 % диметилсульфоксида (Sigma, США) и замораживали при -70?С до использования. Результаты были одинаковыми как при использовании свежих клеток, так и подвергшихся заморозке эпителиоцитов.
Для выделения эпителиоцитов клетки влагалища ресуспендировали в 7,0 мл среды Хенкса (Gibco, США) и распределяли на стерильных нейлоновых мембранах с диаметром пор 20 µм. Эпителиоциты, остававшиеся на мембранах, собирали промыванием 50,0 мл среды Хенкса в стерильные чашки Петри. Потом клетки переносили в центрифужные пробирки объёмом 50,0 мл и центрифугировали при 800 g, после чего удаляли супернатант, и ресуспендировали обогащённый клеточный пул в пептонной среде Phytone (Becton Dickinson, США), к которой добавляли 10 % фосфатно-буферный раствор и 1 % раствор пенициллина (100 МЕ/мл) и стрептомицина (100 нг/мл) (Gibco, США). Количество эпителиоцитов подсчитывали при световой микроскопии мазков, окрашенных трипановым синим. Чистоту пула эпителиальных клеток (>95 %) определяли путём подсчёта 100 клеток в 5 разных полях зрения и выражали как среднее процентное содержание клеток с характерными для эпителиоцитов морфологическими признаками.
Моноциты из периферической крови здоровых доноров выделяли по методу H.R. Recalde (1994) [57, 140]. Чистоту суспензии моноцитов (89-98 %) подтверждали иммунофлуоресцентным методом с использованием моноклональных антител к рецепторам CD14. Жизнеспособность клеток в суспензии подтверждали в тесте с трипановым синим (она составляла 89-93 %).
Популяции лимфоцитов периферической крови человека получали с помощью центрифугирования на градиенте плотности фиколл-верографин 1,077 с последующим лизисом эритроцитов ледяным раствором аммония хлорида. Цельную кровь, разведенную в соотношении 1:1 средой 199, наслаивали на смесь фиколла-верографина и центрифугировали 20 минут при 500 g. Снятые интерфазные кольца мононуклеарных клеток дважды отмывали в течение 10 минут средой 199. Затем ресуспендировали в полной питательной среде. Для подготовки суспензии лимфоцитов в концентрации 2*109/л проводили расчет по формуле: В = (а/40-1)*с, где а - количество лимфоцитов в камере Горяева; с - количество суспензии клеток, оставленных в пробирке; В - количество фосфатно-буферного раствора, которое необходимо добавить. Использование описанного метода позволяет выделять из крови около 90 % лимфоцитов. Суправитальное окрашивание выделенных лимфоцитов трипановым синим свидетельствовало о жизнеспособности 98-99 % клеток.
Во всех опытах использовали эпителиоциты влагалища, опухолевые клетки HeLa, моноциты и лимфоциты в концентрации (5,0?0,25)*105 клеток/мл.
2.2. Методы исследования
Пептидогликаны получали из клеточных стенок бактерий по методу P. K. Peterson и соавт. [137]. Культуры бактерий выращивали в среде, которая содержала пептонный дрожжевой экстракт (0,5 % экстракт дрожжей, 1,3 ммоль К2НРО4, 1,1 ммоль глюкозы, рН=7,2-7,4) и инкубировали при 37?С на протяжении 2-4 часов. Затем бактерии инокулировали в 10 литрах вышеуказанной среды и инкубировали при 37?С на протяжении 24 часов со встряхиванием. Бактерии получали центрифугированием (5000 g, 4?С, 10 минут) и трижды отмывали холодной дистиллированной водой. Бактериальные клетки разрушали копром со стерильными стеклянными шариками диаметром 0,1 миллиметра (Biospec Products, USA). Копёр использовали на протяжении 5 циклов по 90 секунд каждый. После седиментации шариков супернатант собирали и шарики трижды промывали. Супернатанты после промывки центрифугировали (14000 g, 4?С, 4 минуты), а потом выделяли белый верхний слой гранул, который содержал стенки бактериальных клеток. Клеточные стенки ресуспендировали в холодной дистиллированной воде и промывали. Для выявления интактных клеток бактерий использовали окраску по Граму. Клеточные стенки ресуспендировали в 2 % растворе натрия додецилсульфата и инкубировали на протяжении 12 часов. Материал дважды отмывали дистиллированной водой, а потом 0,05 М NaH2PO4 (рН=7,0) и 0,05 М трис-хлористоводородной кислотой (рН=7,5). Клеточные стенки ресуспендировали в 200 мл 0,05 М трис-хлористоводородной кислоты, который содержал 5 ммоль магния хлорид, 5 мг/л ДНКазы (Sigma, США), 5 мг/л РНКазы (Sigma, США) и медленно встряхивали при 37?С на протяжении 1 часа. В конце добавляли 200 мг/л трипсина и смесь встряхивали еще 4 часа. После центрифугирования гранулы ресуспендировали в 50 мл дистиллированной воды, смешивали с 50 мл 80 % фенола и центрифугировали при комнатной температуре на протяжении 30 минут. После этого центрифугирования фракцию клеточных стенок тщательно собирали с поверхности, ресуспендировали в дистиллированной воде и трижды промывали в холодной дистиллированной воде. Затем фракцию ресуспендировали в 20 мл 10 % трихлоруксусной кислоты для удаления ТК и центрифугировали при 4?С 24 часа. Чистый пептидогликан был получен центрифугированием, после чего его ресуспендировали в 10 % трихлоруксусной кислоте и нагревали до 60?С