РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под наблюдением находилось 95 беременных, из них 35 беременных с легкой степенью преэклампсии, 28 преэклампсией средней тяжести, 12 беременных с тяжелым течением преэклампсии. Группу контроля составили 20 здоровых беременных.
Во всех группах обследуемых изучался анамнез жизни, акушерский, а также соматический анамнезы, характер менструальной функции. Исследования проводились в сроке гестации 32-41 неделя, возраст беременных составил от 18 до 35 лет. Помимо общего и акушерского осмотров, всем беременным проводились клинико-лабораторные методы обследования согласно действующим приказам: коагулограмма, определение общего белка, содержания глюкозы в сыворотке крови, ионограмма, уровня креатинина и мочевины. Степень тяжести преэклампсии оценивалась по модифицированной шкале Г.М. Савельевой (1989), в которой учитывались как основные симптомы ПБ, так и длительность заболевания, наличие экстрагенитальной патологии, гипотрофии плода и по действующим протоколам МОЗ Украины.
В качестве материала исследования использовалась сыворотка крови беременных, сыворотка пуповинной крови, а также амниотическая жидкость. Кровь для исследования брали из локтевой вены беременных, амниотическая жидкость собиралась в стерильные пробирки путем произведения трансцервикального амниоцентеза в объеме 1,0 мл. Пуповинная кровь отбиралась после пересечения пупочного канатика.
2.1. Определение общего белка в амниотической жидкости по биуретовой реакции [255, 256]
Принцип метода заключается в том, что белки реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений фиолетового цвета (биуретовая реакция). Интенсивность окраски реакционного раствора прямо пропорциональна содержанию белков в анализируемой сыворотке, АЖ.
Для проведения данного исследования подготавливались следующие растворы: калибровочный раствор альбумина, биуретовый реактив. Достоверность получаемых результатов контролировалась по контрольным сывороткам "Лионорм" или "Биоконт".
Анализ проводили в соответствии со схемой, представленной в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Отмерить в кювету, млКалибровочная или опытная пробаПустая пробамакрополу-микромикромакрополу-микромикроКалибровочный или анализируемый раствор
0,08
0,05
0,04
0,02
-
-
- Физиологический раствор
-
2,5
-
0,08
0,04
0,02
Биуретовый реактив
4,00
2,00
1,00
4,00
2,00
1,00
Содержимое смешивалось и выдерживалось 30 мин. при комнатной температуре (от +18 до +25°С). Измеряли поглощение А калибровочной или опытной пробы против пустой пробы. Фотометрирование производилось при 540-560 нм в диапазоне 0-1,0 ед. Кювета использовалась с длиной оптического пути 10 мм. Расчет концентрации общего белка вели по калибровочному графику. Построение калибровочного графика составлялось в соответствии с рядом разведений, как указано в табл. 2.2.
Таблица 2.2
Калибровочные точкиКалибровочный раствор белка, мл0,9 % раствор хлористого натрия, мл.Концентрация белкаг %г/л1
40,4
0,6
0,8
1,00,6
0,4
0,2
- 4
1040
60
80
100
Полученные растворы обрабатывались, как указано в таблице для калибровочных растворов. По полученным данным строили калибровочные графики.
При содержании белка в сыворотке 10,0 г % и более, сыворотку разводили физиологическим раствором, и результат умножали на коэффициент разведения.
2.2. Определение общего количества альбумина в амниотической жидкости [40, 255]
Принцип метода заключается в том, что альбумин образует в слабокислой среде с индикатором бромкрезоловым зеленым в присутствие детергента окрашенное соединение, интенсивность окрашивания которого пропорциональна концентрации альбумина.
Для проведения опыта необходимы следующие растворы: 1. Рабочий раствор индикатора. Содержимое флакона с реактивом переносилось в мерную колбу объемом 1000 мл и добавляли до метки дистиллированную воду. Реактив считался стабильным от 0 до плюс 8°С. 2. Калибровочный раствор альбумина (50±2) г/л. К флакону, который содержит лиофилизированный альбумин, добавляли 1,9 мл физиологического раствора и осторожно перемешивали реагент считался стабильным от 2 до +8°С.
Достоверность получаемых результатов контролировалась по контрольным сывороткам "Лионорм" или "Биоконт".
Анализ производился в соответствии со схемой, представленной в табл. 2.3.
Таблица 2.3
Отмерить в пробирку, млКалибровочная или опытная пробаПустая пробамакрополу-микромикромакрополу-микромикроКалибровочный или анализируемый раствор
0,04
0,02
0,01
-
-
-Физиологический раствор
0,04
0,02
0,01
Рабочий раствор
4,00
2,00
1,00
4,00
2,00
1,00 Содержимое смешивалось и выдерживалось 5 мин. при комнатной температуре (от +18 до +25°С). Измерялась оптическая плотность калибровочной (Е кал) и исследуемой пробы (Е иссл.) против холостой. Фотометрирование производилось при длине волны 620-640 нм в диапазоне (0-1)ед. оптической плотности и длины оптической волны 10 мм.
Расчет концентрации альбумина производили по формуле: концентрация альбумина в исследуемой пробе, г/л равняется оптическая плотность исследуемой пробы, поделенная на оптическую плотность калибровочной пробы и умноженной на 50.
2.3. Определение перекисного окисления белков в амниотической жидкости [84]
Принцип оценки окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия окислительных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидрозином (2,4-ДФГ) с образованием его производных. В результате окисления белков образуется альдегидные и кетоновые группировки аминокислотных остатков, которые взаимодействуют с 2,4-ДФГ.
Для анализа использовали 0,05-0,1 мл сыворотки венозной крови, сыворотки крови пуповины и амниотической жидкости. Осаждение бе