РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Постановка эксперимента
При выполнении настоящей работы использовали самцов крыс линии Вистар 3- и 24-месячного возраста, содержавшихся в стандартных условиях вивария Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Все исследования на животных проводили с соблюдением Международных принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1985). Объектом исследования служили: печень, изолированные гепатоциты, гиппокамп и кора мозга крыс. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента:
1. Интактные животные 3- и 24-месячного возраста, из печени, гиппокампа и коры мозга которых получали гомогенат ткани при изучении возрастных особенностей содержания и обмена липидов.
2. При изучении влияния L-T4 на содержание липидов в печени и изолированных гепатоцитах использовали животных 3- и 24-месячного возрастаю. Гормон (10-8 М) вводили в культуральную среду и клетки инкубировали в течение 0,5 мин и 24 час.
3. При изучении особенностей воздействия витамина Е на содержание и обмен липидов в печени использовали 24-месячных крыс. Опытной группе крыс вводили витамин Е перорально в дозе 100 мкг на 100 г массы тела в течение 7 дней. Контрольные животные получали кукурузное масло. Кусочки печени или изолированные гепатоциты нормальных 24-месячных крыс прединкубировали в присутствии витамина Е (100 мкг/мл) или кукурузного масла в течение 90 мин при 37°С.
4. При моделировании состояния старой клетки гепатоциты выделяли из печени 3-месячных нормальных крыс. Клетки культивировали при 37°С в течение 6 и 24 час в присутствии пальмитиновой кислоты (0,75 мМ/л), или ее растворителя (среда А /этиловый спирт/БСА.
5. С целью изучения модулирующего действия витамина Е на регуляцию L-T4 обмена липидов использовали кусочки печени или изолированные гепатоциты 24-месячных крыс. Опытной группе крыс вводили витамин Е перорально в дозе 100 мкг на 100 г массы тела в течение 7 дней. Контрольные животные получали кукурузное масло. Кусочки печени или изолированные гепатоциты опытных и контрольных крыс инкубировали в присутствии L-T4 (10 нМ) или растворителя (100 нМ NaOH).
6. С целью изучения модулирующего действия витамина Е на регуляцию L-T4 обмена липидов в изолированных гепатоцитах, прединкубированных в присутствии пальмитиновой кислоты (0,75 мМ/л, 24 час), использовали 3-месячных крыс.
2.2. Эксперименты на гомогенатах тканей
Ткани печени, гиппокампа и коры мозга использовали для получения гомогенатов. Печень животного, наркотизированного диэтиловым эфиром, перфузировали in situ охлажденным до t +4?С изотоническим раствором NaCl, извлекали из брюшной полости и продавливали через перфорированную пластину с диаметром пор 0,3 мм при t +4°С. Ткани гиппокампа и коры измельчали и промывали в охлажденным до t +4?С изотоническом растворе NaCl. Полученные кусочки тканей гомогонизировали и использовали для изучения содержания липидов и включения меченых 14С предшественников в липиды. Синтез липидов и экстракцию липидов из изученных тканей производили, как описано в п. 2.4.
2.3. Эксперименты на изолированных гепатоцитах
Нативность клеточных мембран гепатоцитов, выделенных неферментативным методом [121], оценивали с помощью 0,4 % раствора трипанового синего. Выход жизнеспособных клеток составлял 90?5 %. Гепатоциты ресуспендировали (до концентрации 6·106 клеток в 1 мл) в среде Игла (рН 7,4), содержащей 25 мМ HЕРЕS, пенициллин (61 мг/л), стрептомицин (100 мг/л), 10% эмбриональную сыворотку быка и 2 мкКи/мл [14C]пальмитиновой кислоты и инкубировали при 37°С в течение 90 мин. По окончании инкубации гепатоциты дважды отмывали избытком буфера, содержащим 118 мM NaCl, 5 мM KCl, 1 мM KH2PO4, 1 мM MgSO4, 2 мM CaCl2, 0,2% NaHCO3, 0,1% БСА, 61 мг/л пенициллин, 100 мг/л стрептомицин, рН 7,5 (среде А) охлажденным до 4°С. В последствии гепатоциты разводили до концентрации 106 клеток на 1 мл в среде А. В отдельных случаях изолированные гепатоциты прединкубировали в присутствии витамина Е (100 мкг/мл) или кукурузного масла в течение 90 мин при 37°С. Эти клетки подвергали дальнейшей инкубации в присутствии 10 нМ L-Т4 или 100 нМ NaOH в течение 0,5 мин при 37°C. Реакцию останавливали добавлением охлажденной до 4?С смеси xлороформа с метанолом (1:2, об/об) и проводили экстракцию липидов как описано в п. 2.4.
2.4. Экстракция липидов
Липиды из гомогенатов тканей и изолированных гепатоцитов экстрагировали по методу Bligh, Dyer [122] в смеси хлороформ: метанол (1: 2, по объему), встряхивая. Полученный экстракт центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу отбирали, ткань дополнительно экстрагировали смесью хлороформ: метанол: Н2О (1:2:0,8, по объему) и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. Супернатанты объединяли и приливали хлороформ и Н2О. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин. Верхнюю фазу отбрасывали, а нижнюю выпаривали под вакуумом при температуре +37оС. Сухой осадок растворяли в смеси хлороформ: метанол (2:1, по объему) и использовали для тонкослойной хроматографии.
2.5. Разделение липидов с помощью тонкослойной хроматографии
Липиды разделяли на фракции в тонком слое силикагеля на коммерческих пластинках: Sorbfil в восходящем токе растворителей. ДАГ разделяли в системе растворителей: гексан: диэтиловый эфир: СН3СООН (73:25:2, по объему). Для разделения СФМ, ФХ, ФЭА и церамида использовали 2 системы растворителей: 1 - диэтиловый эфир, 2 - хлороформ: метанол: Н2О (40:10:1, по объему) [123]. Для разделения ФЭЦ, ГЛЦ и СФЗ выпаренный экстракт липидов инкубировали 60 мин при 37?С в cреде: хлороформ - метанол (1:1, об/об), содержащей NaOH (0,1 М), для гидролиза ацилглицеринов. Липиды вновь экстрагировали [122] и использовали для разделения на классы в системе растворителей: хлороформ: этилацетат: изопропиловый спирт: мета