РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Матеріали
У роботі використовували лізоцим з яєчного білка, флуоресцеїн 5'-ізотіоціанат (Fl) та родамін-В-ізотіоціанат (Rd), пірен та N-(1-пірен)малеїмід (РМ), детергент цетилтриметиламоній бромід (ЦТАБ), стерол холестерин (Хол) та 4-(2-гідроксиетил)-1-піперазінетансульфонова кислота (HEPES) фірми "Sigma" (США), ФХ з яєчного жовтка та КЛ з серця бика (концерн "Біолік", Харків), 1-пальмітоїл-2-олеоїл-sn-гліцеро-3-фосфо-rac-гліцерол (ФГ) та 1-пальмітоїл-2-олеоїл-sn-гліцеро-3-фосфо-rac-фосфатидилсерин (ФС) фірми "Avanti Polar Lipids" (США), діфенілгексатрієн (ДФГТ) фірми "EGA Chemie" (Німеччина). Сквараїнові флуорофори Square-670-NHS, Seta-635-NHS та К1350 було синтезовано в НТК "Інститут монокристалів" НАН України, м. Харків, зонд SQ-1 було синтезовано в Університеті Софії "Св. Клімент Охридський", м. Софія, Болгарія. Флуоресцентні ліпідні аналоги 1-ацил-2-[12-(9-антріл)-11-транс-додеценоїл]-sn-гліцеро-3-фосфохолін (антріл-вініл-фосфатидилхолін, АВ-ФХ) та 1-ацил-2-[12-(9-антріл)-11-транс-додеценоїл]-sn-гліцеро-3-фосфо-1-rac-гліцерол (антрілвініл-фосфатидил- гліцерол, АВ-ФГ) було синтезовано в Інституті Біоорганічної хімії ім. М.М. Шемякіна і Ю.А. Овчинникова, м. Москва, Росія.
2.2. Об'єкти досліджень
Формування ліпосом. Уніламелярні ліпосоми різного складу готували методом екструзії [143]. Розчини ліпідів в етанолі чи хлороформі змішували в необхідних пропорціях та поміщали отримані суміші під вакуумний насос на 10-30 хвилин (в залежності від складу ліпосом) для випаровування розчинника. Ліпідні плівки гідратували 5 мМ натрій-фосфатним буфером чи 20 мМ HEPES буфером.
Рис. 2.1. Схема формування уніламелярних ліпідних везикул методом екструзії.
Одержані таким чином мультиламелярні ліпосоми пропускали крізь полікарбонатний фільтр з діаметром пор 100 нм за допомогою екструдеру (рис. 2.1). Концентрація ліпосом визначалася за методикою Бартлета [144].
Лізоцим. При приготуванні концентрованого розчину лізоциму 3 мг сухого білка розчиняли у 6 мл натрій-фосфатного буферу (5 мМ, рН 7.4). Одержаний розчин фільтрували через паперовий фільтр FILTRAK No.90. Концентрацію лізоциму () визначали спектрофотометричним методом на основі закону Бугера-Ламберта-Бера:
, (2.1)
де - поглинання лізоциму на 280 нм, М-1см-1 - молярний коефіцієнт екстинкції білка при 280 нм, - довжина оптичного шляху (у даній роботі 1 см).
2.3. Ковалентне мічення лізоциму флуоресцентними мітками
Для ковалентного мічення лізоциму використовували мітки, реактивними групами яких були ізотіоціанат (Fl) та сукцинімідний ефір (Square-670-NHS й Seta-635-NHS).
Мічення флуоресцеїном. Мічення лізоциму Fl проводилося по методу Кока та ін. [145]. Fl та лізоцим розчиняли у 100 мМ боратному буферному розчині, рН 9.1, для отримання еквімолярних концентрацій білка та мітки (110 мкМ). Після інкубації зразків при температурі 25°C протягом 90 хвилин в умовах постійного перемішування у темряві рН знижували до 7.4. Потім розчини переносили в діалізні касети та діалізували при 4°C проти суміші 20 мМ HEPES з 0.1 мМ EDTA, рН 7.4 протягом ночі.
Ступінь мічення (молярне відношення мітка:білок, D:P) визначали з використанням молярних коефіцієнтів екстинкції флуоресцеїну М-1см-1, М-1см-1. Знайдене таким чином значення D:P складало 0.9.
Мічення сквараїновими мітками. Для приготування концентрованих розчинів сквараїнових міток 1 мг Square-670-NHS або Seta-635-NHS (рис. 2.2) розчиняли у 100 мкл діметилформаміду [146]. Після цього 15.3 мг лізоциму розчиняли у 10 мл 100 мМ боратного буферу, рН 9.1. Потім 20 мл концентрованого розчину міток додавали по краплі при постійному перемішуванні до 3 мл розчину лізоциму. Суміш інкубували 3 години при температурі 25°C у темноті.
Рис. 2.2. Структурні формули Square-670-NHS (ліворуч) та Seta-635-NHS (праворуч).
По закінченню реакції кон'югації незв'язані мітки були видалені діалізом при 4°C проти 20 мМ HEPES, рН 7.4, протягом ночі. Для запобігання деструкції сквараїнових міток діалізний мішечок був обернений у фольгу. Ступінь мічення визначали, використовуючи молярні коефіцієнти екстинкції М-1см-1, М-1см-1, М-1см-1, М-1см-1. Відношення D:P для обох міток становило 0.1.
2.4. Флуоресцентні вимірювання та первинна обробка даних
Вимірювання флуоресценції проводили при температурі 24 ?С на спектрофлуориметрі LS-50B (Perkin-Elmer, Велика Британія) та спектрофлуориметрі/спектрофотометрі CM 2203 (ЗАО "SOLAR", Бєларусь), обладнаних термостатованими кюветодержателями та магнітними мішалками. Ці прилади давали скориговані спектри збудження і випромінювання. При вимірюваннях використовували кювети з розмірами 11 см. рН розчинів контролювали за допомогою іономера універсального ЭВ-74 (ЗИП, Росія).
2.4.1. Дослідження зв'язування лізоциму з модельними мембранами
Спектри флуоресценції флуоресцеїн-міченого лізоциму реєстрували в буфері та у суспензії ліпосом. Довжина хвилі збудження була 470 нм. Криві зв'язування отримували, вимірюючи ліпід-індуковані зміни інтенсивності флуоресценції мітки на довжині хвилі 514 нм () в залежності від загальної концентрації ліпіду. Припускали, що зміна інтенсивності флуоресценції пропорційна концентрації сорбованого білка, тобто виконується співвідношення:
, (2.2)
де - максимальна зміна інтенсивності флуоресценції, що відповідає області плато (насиченню) на кривих зв'язування. Початкові оцінки отримували по перетину прямої з віссю ординат шляхом екстраполяції в область . Отримані таким чином значення були уточнені при апроксимації експериментальних даних певною моделлю адсорбції. Ця процедура включає мінімізацію функції:
, (2.3)
де Nе - число експериментальних точок (у нашому випадку, число концентрацій ліпіду), - концентрації зв'язаного білка, розраховані з експериментальних даних та шляхом чисельного розв'язання системи рівнянь, що описують певну модель, відповідно. При визначенні концентр