РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
В "Огляді літератури" показано, що цілий ряд питань, пов'язаних з особливостями обміну нітратів і нітритів у рубці жуйних, досліджено в недостатній мірі. Це стосується зокрема впливу нітратів і продуктів їх перетворення - нітритів на життєдіяльність мікроорганізмів рубця, впливу їх на продукти пероксидного окиснення ліпідів та активність ферментів антиоксидантного захисту, ролі мікроелементів та інших модуляторів в їх перетворенні, вікових особливостей цих процесів. Цим і зумовлена актуальність досліджень впливу нітрату і нітриту на метаболічні процеси в рубці жуйних тварин.
Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні завдання:
1. Провести порівняльне дослідження впливу нітрату натрію та сечовини на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят;
2. Дослідити вплив нітрату натрію разом з мікроелементами на життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят;
3. Визначити активність нітрат- і нітритредуктази мікроорганізмів рубця телят за дії різних акцепторів і донорів водню, мікроелементів та інших модуляторів;
4. Дослідити рівень нітратредуктазної активності у мікроорганізмів рубця;
5. Провести дослідження впливу нітрату і нітриту на активність ферментів антиоксидантного захисту мікроорганізмів рубця телят;
6. Проаналізувати вплив метанолу, етанолу і лактату на відновлення нітрату у рубці телят;
7. Вивчити вікові особливості відновлення нітратів і нітритів у рубці телят;
8. Визначити залежність нітрат- і нітритредуктазної активності і життєдіяльність мікроорганізмів рубця від концентрації водневих іонів.
2.1. Характеристика тварин, взяття дослідного матеріалу
Дослідження проводились упродовж 2004-2006 рр. у дослідному господарстві "Чишки" Інституту біології тварин УААН на телятах української чорно-рябої молочної породи різного віку (1, 3, 6, і 12 місяців). Тварин годували згідно з деталізованими нормами (Калашникова А. П. с соавт., 2003) [81]. До раціону телят входили сіно лугове, комбікорм, соковиті корми. Комбікорм містив ячмінну - 50 %, пшеничну - 25 %, горохову - 10 % дерть, макуху соняшникову - 14 %, мінерально-вітамінний премікс - 1 %. Поживна вартість раціону за вмістом протеїну, мінеральних елементів і вітамінів відповідала віковим потребам телят. Утримання тварин - стійлове.
2.1.1.Взяття матеріалу і фракціонування вмісту рубця
Для біохімічних досліджень вміст рубця відбирали через 2 години після ранкової годівлі тварин за допомогою приладу, виготовленого на основі колби Бунзена та вакуумної помпи Комовського, фільтрували його через 4 шари марлі і доставляли у щільно закритому термосі в лабораторію. Одержані зразки вмісту рубця розділяли на окремі фракції (бактерії, інфузорії, кормові частки, безклітинну рідину) [Алиев, Кафаров, 1971]. При цьому фільтрат центрифугували упродовж 20 хв при 2000 об/хв. Одержаний супернатант розділяли шляхом центрифугування упродовж 20 хв при 20 тис об/хв на безклітинну рідину (фракція 1) і бактерії (фракція 2). Осад, одержаний після першого центрифугування, розчиняли у фільтраті, додавали калій фосфатний буфер (рН 7,0), що містить глюкозу, натрій ацетат і магній сульфат та інкубували у 250 мл ділильній воронці за температури 38оС упродовж 60 хв. Фракцію інфузорій відбирали із нижнього, білого шару (фракція 3), а кормові частки - з верхнього шару (фракція 4). Зразки 2 і 3 фракцій двічі промивали 0,05 М тріс-HCl буфером (рН 7,2) з наступним центрифугуванням при 20 тис об/хв упродовж 10 хв. Одержані клітини (осад) використовували у дослідженнях. Для визначення активності і очищення ферментів осад клітин гомогенізували на ультразвуковому дезінтеграторі УП-1 (Selmi).
2.2. Схема досліджень
Проведено 8 серій досліджень.
Серія 1.
У цій серії досліджень визначався вплив нітрату натрію на ріст і життєдіяльність мікроорганізмів рубця телят. Дослідження проводилися на 3-х телятах з фістулами 6-місяців. Вміст рубця відбирали через 2 години після ранкової годівлі і фільтрували через 4 шари марлі. Одержані зразки переносили в анаеробних умовах в буферну суміш (200 мл/л), яка містила (г/л): K2HPO4 - 5,0; KH2PO4 - 4,0; NaCl - 0,52; MgSO4.7H2O - 0,070; CaCl2 - 0,035; NaHCO3 - 5,9; цистеїну хлориду - 0,174 [166; 203-205]. Після змішування, 50 мл цієї суміші вносили в 120 мл посудини і додавали як джерело азоту сечовину (15 ммоль/л) або NaNO3 (30 ммоль/л), як джерело енергії - глюкозу (15 ммоль/л). Посудини закривали корками, продували СО2 і інкубували упродовж 24 годин за температури 38?С. До і після закінчення інкубації відбирали зразки рідини і газу для досліджень. В зразках рідини визначали шляхом зважування масу бактерій і інфузорій після висушування фракцій, вміст білка, загальних летких жирних кислот, лактату, аміаку, протеолітичну, целюлолітичну, амілолітичну, нітратредуктазну і нітритредуктазну активність. У зразках газової фази визначали СН4 та коротколанцюгові жирні кислоти на газовому хроматографі.
Серія 2.
Дослідження впливу нітрату натрію і мікроелементів на життєдіяльність мікроорганізмів проведено на 3-х телятах 6-місяців. Відбір зразків, обробка і інкубація проводилися як в попередньому досліді. Перед інкубацією зі зразками в інкубаційні посудини додавали окремо Na2SeO3, FeCl3, CrCl3, Na2CrO4, CuСl2, ZnCl2, Na2MoO4 i MnCl2 (по 10 ммоль/л). Як джерело азоту додавали нітрат натрію (30 ммоль/л), як джерело енергії - глюкозу (30 ммоль/л). Контролем слугували зразки вмісту, в які не додавалися досліджувані мікроелементи. До і після інкубації у зразках рідини визначали масу бактерій і інфузорій, вміст білків, загальних летких жирних кислот, лактату, аміаку. У зразках газової фази визначали вміст метану.
Серія 3.
Дослідження цієї серії, які стосувались впливу різних акцепторів і донорів водню і електронів були проведені на 3-х бичках 12-місяців. Відбір зразків, обробка і інкубація проводилися як в попередніх дослідах. До інкубаційних зразків додавали як джерело енергії 30 ммоль/л глюко