РОЗДІЛ 2
мАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Об’єкти дослідження
Об’єктом дослідження були 14 штамів бактерій роду Lactobacillus з музею культур
кафедри промислової біотехнології, факультету біотехнології і біотехніки
Національного технічного університету України «Київський політехнічний
інститут» (табл.2.1).
Таблиця 2.1
Об’єкти дослідження
Назва штаму
Походження
L. delbrueckii subsp. bulgaricus LB86 ВКПМ-В-5788
Завод біо- та ферментних препаратів «Ензим»
L. delbrueckii subsp.delbrueckii DSM20074
Німецька колекція DSMZ
L. bulgaricus LB51
Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України
L. murinus DSM20452
Німецька колекція DSMZ
L. murinus LE IMB B-7037
Некомерційні молочнокислі продукти *
L. rhamnosus LB3 IMB B-7038
Некомерційні молочнокислі продукти *
L. rhamnosus (C)
Institute Rossell INC, Canada
L. acidophilus (C)
Некомерційні молочнокислі продукти *
L. rhamnosus V®
Pure Research Products, Colorado, USA
L. plantarum
Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України
L. acidophilus+L. rhamnosus (C)
Institute Rossell INC, Canada
L. sp. LB4
Некомерційні молочнокислі продукти *
Штами порівняння
L. acidophilus EP317/402
Біологічно активна добавка «Наріне» *
L. plantarum
Препарат Лактобактерин *
Примітка: * - культуру виділено на кафедрі промислової біотехнології НТУУ
«КПІ»; ВКПМ – всеросійська колекція промислових мікроорганізмів; DSMZ – Deutche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen; ІМВ – інститут мікробіології і
вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України
2.2. Поживні середовища та умови культивування мікроорганізмів
Лактобактерії культивували в термостаті (ТС-80М-2) при 37оС на рідкому,
напіврідкому та твердому середовищі MRS в залежності від методу, протягом 48
годин. Джерело вуглецю в середовищі – глюкоза; джерела азоту – пептон
ферментативний, м’ясний бульйон, цитрат амонію.
Бактеріальні тест-культури вирощували в термостаті при температурі 37оС на
м'ясо-пептонному агарі (МПА) протягом 48 годин.
2.3. Методи вивчення харчових потреб, динаміки росту та біосумісності
лактобактерій
Зброджування джерел вуглецевого живлення досліджували на MRS-бульйоні без
додавання м’ясного екстракту та вуглеводів, відповідно до методики. В
середовище вносили індикатор бромкрезоловий пурпурний. Облік результатів
проводили протягом 10 діб культивування. Реакцію вважали позитивною при зміні
кольору середовища від фіолетового до лимонно-жовтого [130].
Побудову кривих росту бактерій проводили стандартним методом [131]. Культури
вирощували на рідкому середовищі MRS при 37оС та через певні проміжки часу
вимірювали оптичну густину на КФК-3-01 при л-540 нм та l-0,5 см. Розрахунок
питомих швидкостей росту проводили за формулою:
де N та N0 – число клітин у момент часу відповідно t та t0.
Оцінку біосумісності лактобактерій проводили шляхом попарного сумісного
культивування бактерій на твердому MRS-середовищі [75].
2.4. Методи дослідження антагоністичних активностей лактобактерій
Антагонізм лактобактерій по відношенню до тринадцяти культур грампозитивних та
грамнегативних бактерій з музею культур кафедри промислової біотехнології НТУУ
«КПІ»: Sarcina flava, Staphylococcus citreus, Staphylococcus aureus, Bacillus
mycoides, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Nocardia
carollina, Escherichia coli, Acinetobacter colcoaceticus, Klebsiella pneumonia,
Pseudomonas fluorescens, Brevibacter linens, Serratia marcescens визначали
методом перпендикулярних штрихів на середовищі MRS з глюкозою та без неї [130].
Тест-культури підсівали через 24 години культивування лактобактерій [73].
Ступінь чутливості тест-культур оцінювали за розмірами зон затримки росту: 5-15
мм – малочутливі, 15-20 мм – помірно чутливі; 20-30 мм – чутливі; 30-40 мм –
високочутливі [130].
Активність кислотоутворення визначали титрометричним методом через 24, 48, 72
та 96 годин вирощування клітин [130]. Кінцевий результат виражали в градусах
Тернера.
Концентрацію перекису водню в середовищі культивування молочнокислих бактерій
визначали титрометрично через 24, 48, 72 та 96 годин вирощування клітин [132].
Продукцію лізоциму визначали методом агарових пластинок через 24, 48, 72 та 96
годин вирощування клітин. Про ступінь лізоцимсинтезуючої активності судили за
шириною зони просвітлення: 1-3 мм - низька, 4-7 мм - середня та 8 мм - висока
[133].
2.5. Методи визначення адгезивної активності
Адгезивну активність визначали розгорнутим (пробірочним) методом на нативних та
формалізованих еритроцитах крові людини. Адгезію молочнокислих бактерій
оцінювали за наступними показниками: ІАМ – індекс адгезивності мікроорганізмів,
СПА – середній показник адгезії, К – коефіцієнт участі клітин макроорганізму в
адгезивному процесі. Штами із значенням ІАМ?1,75 відносили до неадгезивних, з
ІАМ 1,76-2,5 – низькоадгезивних, з ІАМ 2,51-4,0 – середньоадгезивних, з ІАМ ?
4,0 – високоадгезивних [134].
Формалінізація еритроцитів. Донорську кров В/ІІ (Rh+) чотири рази відмивали
фосфатно-сольовим буфером при 1000-1500 об/хв. протягом 10хв. Готували 8%
суспензію еритроцитів. Додавали рівний об’єм 3% розчину формаліну. Витримували
протягом 18 годин при 37оС, періодично струшували. Після цього еритроцити тричі
відмивали фосфатно-сольовим буфером, готували 50% суспензію, що містила 0,3%
формаліну. Приготовані таким чином еритроцити можуть зберігатися протягом року
[135].
2.6. Методи перевірки резистентності лактобактерій до дії антибіотиків
Резистентність до антибіотиків, що відносяться до різних груп та
характеризуються різним механізмом дії на мікробну клітину вивчали методом
дифузії в агар [136]. Результати оцінювали за розмірами зон затримки росту
лактобактерій (т
- Київ+380960830922