РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота являє собою експериментально-морфологічне дослідження, в якому в
дослідах на білих нелінійних щурах (Rattus norvegicus L.) моделювали токсичні
ураження периферійної нервової системи шляхом введення антибластомних
хіміопрепаратів – етопозиду, доксорубіцину, цисплатину та вінкристину. Вибір
середників зумовлений тим, що вони належать до різних класів цитостатиків, їм
властивий нейротоксичний вплив на периферійну нервову систему, який доведений у
клінічних спостереженнях і дослідах in vivo та in vitro.
У роботі використано комплекс морфо-функціональних методик, які включають
нейрогістологічні та ультраструктурні способи досліджень, маркерні гістохімічні
методики вивчення проникливості судин гемомікроциркуляторного русла на
світлооптичному та ультраструктурному рівнях. Отримані матеріали досліджені за
допомогою аналізатора зображень з використанням комп’ютерних морфометричних
технологій. При виборі методик дослідження враховано рекомендації Міжгалузевого
Комітету з Нейротоксикології (Interagency Committee on Neurotoxicology) [130].
Тварини утримувались у стандартних умовах віварію з вільним доступом до
природніх кормів та води. Утримання тварин та маніпуляції проводились у
відповідності до положень “Загальних етичних принципів експериментів на
тваринах”, ухвалених Першим Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001), та
вимог Додатку 4 до “Правил проведення робіт з використанням експериментальних
тварин”, затверджених Наказом Міністерства охорони здоров’я №755 від 12 серпня
1977 р. “Про заходи щодо подальшого удосконалення організаційних форм роботи з
використанням експериментальних тварин”.
В якості дослідних і контрольних використано тварин обох статей, маса тіла яких
на початок досліду становила 200,0 – 220,0 г. Всього в роботі використано 299
дослідних і 162 контрольних тварини, в т.ч.: в експериментах з вивчення
Е-індукованої периферійної нейропатії використано56 дослідних і 30 контрольних
тварин, Д-індукованої периферійної нейропатії – 93 і 52, ЦП-індукованої
периферійної нейропатії – 95 і 50, викликаної В – 56 і 30 відповідно. Розподіл
експериментальних та контрольних тварин за серіями дослідів та застосованими
методами вивчення периферійних нервів і їх сегментарних центрів приведено в
таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл дослідних і контрольних тварин за видами досліду та використаними
методами дослідження
Нейрогістологічні
(у т.ч. морфометричні) і ультрамікроскопічні методи дослідження СМ, СМВ, СН
Метод вивчення проникливості мікрогемосудин за допомогою ПХ
Дослід
Контроль
Дослід
Контроль
Е-індукована периферійна нейропатія
31
15
25
15
Д-індукована периферійна нейропатія
51
26
42
26
ЦП-індукована периферійна нейропатія
53
25
42
25
В-індукована периферійна нейропатія
31
15
25
15
Розрахунок дози препаратів при багаторазових введеннях проводився на основі
контрольних зважувань. Довенні ін’єкції препаратів і гістохімічних маркерів
проводили з використанням інтраперитонеального нембуталового наркозу з
розрахунку 4 мг на 100 г маси тіла тварини в стерильному ізотонічному розчині
NaCl. Інтраперитонеальне введення ЦП і підшкірне введення стерильного
ізотонічного розчину NaCl проводили під поверхневим інгаляційним ефірним
наркозом. Аналогічно проводили знечулення контрольних тварин. Умертвіння
здійснювали шляхом передозування інгаляційного наркозу повітряною сумішшю
стабілізованого етилового ефіру.
2.1. Методи моделювання експериментальних токсичних периферійних нейропатій,
які виникають під впливом хіміотерапевтичних середників
Вибір способів відтворення в експерименті токсичних периферійних нейропатій,
викликаних антибластомними препаратами, проводився з врахуванням основних
критеріїв – максимальна схожість за клінічними, нейрофізіологічними і
морфологічними критеріями до ятрогенних уражень периферійної нервової системи,
що виникають у хворих на злоякісні новотвори при проведенні хіміотерапії,
частота використання в однотипних дослідженнях, які проводяться в інших
лабораторіях, наближеність у дозуванні і схемах введення до тих, що
застосовуються в онкологічній клініці, мінімальна травматизація дослідних
тварин.
При плануванні термінів забору матеріалу та тривалості дослідження
враховувались дані попередньо проведених пілотних експериментів, які дозволили
виявити динаміку розгортання патологічного процесу та часу виникнення
нейропатії як стійкого якісно і кількісно нового стану, який відповідає
загальноприйнятим у літературі критеріям. Усі використані в роботі
експериментальні моделі відповідали вимогам репрезентабельності та
відтворюваності (у 98,0 – 100,0 % тварин вдалося викликати характерні ураження
периферійних нервів та їх сегментарних центрів).
Протягом усього періоду дослідів проводився контроль за поведінковими реакціями
та локомоторною активністю тварин.
Нейротоксичний вплив Е вивчали на експериментальній моделі, запропонованій C.L.
Bregman [52], яка передбачає одноразове довенне введення препарату в дозі 22
мг/кг маси тварини. У дослідах використано ЕТОПОЗИД виробництва фірми Ebewe
(Австрія). Тваринам контрольної групи вводився ізотонічний розчин NaCl
еквівалентного об’му. Забір матеріалу дослідних і контрольних тварин проводили
на 3,7 і 15 доби експерименту.
Патоморфологію токсичного ураження периферійної нервової системи, викликаного
Д, вивчали в тварин, яким одноразово довенно вводили препарат доксорубіцин
виробництва австрійської фірми Ebewe в дозі 10 мг/кг маси тіла [90]. Тварини,
яким вводили довенно ізотонічний розчин NaCl еквівалентного об’єму, служили в
якос
- Київ+380960830922