РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Общая схема эксперимента
Эксперименты проведены на 207 белых лабораторных крысах линии Вистар (на начало экспериментов - возраст три месяца, вес 160,8+10,5 г) в условиях моделирования интоксикации организма вредными факторами металлургического производства (SiO2; SО2; CO2; N2O2 и др.) или ацетатом свинца с последующим воспроизведением травматического повреждения в мыщелке бедренной кости коленного сустава.
Исследование выполнено в семи сериях экспериментов:
1-я серия, контрольная (интактные животные) - 10 крыс.
2-я серия, контрольная - моделирование травматического повреждения в дистальном мыщелке бедренной кости коленного сустава у интактных животных (28 крыс).
3-я серия, опытная - интоксикация крыс ацетатом свинца в течение 2,5 мес. (28 крыс). Выбранный срок выведения животных из эксперимента обоснован данными литературы [77] по моделированию свинцовой интоксикации у животных.
4-я серия, опытная - интоксикация животных вредными химическими веществами металлургического производства в течение
1,5 мес. (131 крыса). Выбранный срок исследования основан на данных В.Н. Никитина [139] об особенностях метаболизма крыс.
Из опытных вышеуказанных групп по 8 животных было выведено из эксперимента для гистологической оценки изменений в тканях коленного сустава после действия химически вредных веществ по сравнению с крысами, которые служили контролем. Остальные животные были распределены по следующим сериям эксперимента.
5-я серия, опытная - внутрисуставное травматическое повреждение на фоне интоксикации животных вредными веществами металлургического производства в течение 1,5 мес. (40 крыс) (табл. 2.1).
6-я серия, опытная - внутрисуставное травматическое повреждение на фоне 2,5-месячной интоксикации ацетатом свинца (18 крыс).
7-я серия, опытная - экспериментальное изучение целесообразности применения румалона и остеохина в различные периоды посттравматического внутрисуставного повреждения у животных, содержавшихся в условиях действия вредных химических факторов металлургического производства (83 крысы).
Таблица 2.1
Сроки начала лечения животных остеохином и румалоном
Сроки наблюдения
(сутки)Контроль, интоксикация+ травматическое повреждение
(без лечения)Опытные серииЛечение с первых сутокЛечение
с 7-х сутокЛечение
с 14-х сутокКоличество животных71111--1491011-2111910-459101111ВСЕГО40403211
Препараты (остеохин и румалон) вводили по схеме, включительно до 45 суток (см. таблицу 2.1).
Лечение остеохином проводили в дозе 0,4 мг на 100 г живой массы (per os, ежедневно). Румалон вводили внутримышечно в дозе 0,05 мл на 100 г живой массы - 3 раза в неделю.
Животные были выведены из эксперимента на 7, 14, 21 и 45 сутки путем передозировки тиопентала натрия. Для гистологического исследования выделяли оперированные коленные суставы. Изучали материал методами световой и электронной микроскопии.
Экспериментальные исследования на животных проводились в соответствии с международными требованиями о гуманном обращении с животными, соблюдая правила "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, использующихся в экспериментальных и других научных целях" [256].
2.2. Интоксикация белых лабораторных крыс вредными факторами металлургического производства
Животных в течение 1,5 мес. содержали в металлургическом цехе, воздух которого содержал: пыль 18,0 мг/м3 (ПДК 4,0 мг/м3), SiO2 15,5%, сернистый ангидрид 24,7 мг/м3 (ПДК 10,0), двуокись азота 5,5 мг/м3 (ПДК 2 мг/м3), окись углерода 18,9 мг/м3 (ПДК 20,02 мг/м3), следы алюминиевой пыли и фенола.
Через 1,5 месяца у части животных воспроизводили модель травматического повреждения коленного сустава.
2.3. Интоксикация организма белых лабораторных крыс ацетатом свинца
Животным в течение 2,5 месяцев внутрижелудочно зондом вводили раствор ацетата свинца в дозе 100 мг/кг. Выбор этой дозы был обусловлен данными, что максимальная кумуляция свинца в кости происходит в первые месяцы воздействия свинца на организм и в большей степени зависит от величины суточной дозы, чем от продолжительности опыта и суммарной дозы [126].
Контрольным животным внутрижелудочно зондом вводили дистиллированную воду.
Через 2,5 месяца у части животных воспроизводили модель травматического повреждения коленного сустава.
2.4. Воспроизведение модели травматического повреждения коленного сустава у белых лабораторных крыс
Модель травматического повреждения коленного сустава производили путем нанесения стандартного дырчатого дефекта в области латерального мыщелка бедренной кости крыс. Дефект выполняли следующим образом. Животные находились под тиопенталовым наркозом. Посредством бокового доступа вскрывали коленный сустав, отводили в сторону надколенник и зубоврачебным бором наносили дефект, проникающий через суставной хрящ в субхондральную кость, в виде округлого отверстия (диаметр 2 мм, глубина 3 мм). Затем надколенник возвращали в исходное положение. Рану послойно ушивали. На протяжении эксперимента проводили наблюдение за животными.
2.5. Гистологический анализ материала
Материалом для гистологического исследования служили оперированные коленные суставы белых лабораторных крыс, которые были выделены после выведения животных из опыта. Материал фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина, декальцинировали в 5% растворе азотной кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заключали в целлоидин [183]. Изготавливали срезы толщиной 7-10 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином, а также пикрофуксином по ван Гизон.
Для определения особенностей макромолекулярной организации матрикса суставного хряща - гликозаминогликанов и коллагена - была поставлена реакция с толуидиновым синим (рН 2,5) (контроль - обработка гиалуронидазой) [319] и пикроси