РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень
Дослідження проводились на дворічках коропа лускатого (Cyprinus carpio L.) масою 200 - 250 г (430 екземплярів) та двостулковому молюску беззубці лебединій (Anodonta cygnea L.) з діаметром мушлі близько 10 см і масою 8 - 12 г (90 екземплярів). Тварин адаптували до умов басейна протягом 7 діб. Молюски, у яких досліджували стан показників в природних умовах, після відбору зі ставу утримувались у відстояній воді не більше доби.
Дослідних риб виловлювали траловим методом із ставків Тернопільського обласного рибкомбінату (урочище Залісці). Екземпляри молюсків збирали в травні та вересні на мілководній ділянці Тернопільського ставу на глибині біля 50 см.
Експериментальні умови створювали в басейнах об'ємом 200 л з кількістю риб з розрахунку 1 особина на 40 л води. Вміст кисню у воді підтримували на рівні 7,0 - 8,0 мг/л, вуглекислого газу - 2,2 - 2,8 мг/л, рН - 7,6 - 8,0. Воду відстоювали і змінювали щодводобово. Температура води коливалась в межах 100С - 180С залежно від сезону. Тварин не годували.
В кожному лабораторному досліді одна група була контрольною, іншій (іншим) у воду додавали солі ВМ. Вміст у воді Cu2+ (CuSO4) складав 0,01; 0,1, 0,2, 0,5 або 1,0 мг/л; Zn2+ (ZnSO4) - 0,1; 2,0 або 5,0 мг/л; Mn2+ (MnCl2) - 0,13; 2,6 або 6,0 мг/л; Pb2+ (Pb(NO3)2) - 0,01; 0,2 або 0,5 мг/л. При дослідженні дії суміші йонів вміст компонентів складав Zn2+ - 0,1 мг/л, Cu2+ - 0,01 мг/л, Mn2+ - 0,13 мг/л, Pb2+ - 0,01 мг/л. Вміст металу у воді створювали додаванням солей фірми "Реахим" кваліфікації "хч" і контролювали за допомогою атомно-абсорбційної спектроскопії.
Найменша досліджувана концентрація кожного металу була близькою, або нижчою, ніж його середній вміст у прісних водоймах України [71]. Найвищі створювані нами концентрації не приводили до летального наслідку протягом 14 діб інкубації. Лише доза 1,0 мг/л міді викликала загибель риб після 2 діб інкубації. Для зручності при порівнянні трьох досліджуваних концентрацій їх позначали як мала концентрація (МК), середня концентрація (СК) і велика концентрація (ВК). Відповідний вміст аніонів у воді був на один або два порядки нижчими, ніж їх дозволений вміст у рибогосподарських водоймах [24] та вміст у акваріумах.
Перебування риб у воді за дії міді становило 2, 7 і 14 діб, свинцю - 7 і 14 діб, цинку, марганцю та суміші йонів - 14 діб, витримування молюсків - 14 діб. Період в 14 діб вважається найбільш оптимальним для аклімації гідробіонтів до дії екстремальних факторів [83].
Для аналізу використовували у коропа передню долю печінки і плазму крові, взятої із серця з додаванням гепарину, в окремих дослідженнях ентероцити та зяброві дуги, а в молюска - травну залозу, зябра та мантію. В ряді дослідів у коропа визначали гепатотоксичність за соматичним індексом - відношенням маси печінки до маси тіла [384]. Тканину подрібнювали за допомогою гомогенізатора Поттера. Всі процедури з виділення і обробки зразків проводились на холоді. Всі реактиви, крім нижче зазначених, були фірми "Реахим" кваліфікації "хч".
2.2. Виділення і аналіз термостабільних білків тканин риб і молюсків
2.2.1. В и д і л е н н я і г е л ь х р о м а т о г р а ф і я Т Б. Розчин ТБ одержували з гомогенату тканини в 0,01 М трис-НСl буфері, рН 8,0. Гомогенат з 500 мг тканини центрифугували протягом 45 хв при 10 000 g. Отриманий надосад інкубували 5 хв при 850С і знову центрифугували в тих самих умовах. Надосад використовували для дослідження. Термостабільні білки розділяли на фракції за допомогою хроматографії на сефадексі G-75 ("Pharmacia"), використовуючи об'єднані аліквотні частини печінки всіх риб експериментальної групи [384]. Загальна маса наважки при виділенні матеріалу для визначення УФ-спектрів та вмісту металів у фракціях становила 350 - 500 мг, а для йонообмінної хроматографії, амінокислотного аналізу та електрофорезу - 1 г. Елюцію здійснювали 0,01 М трис-НCl буфером, рН 8,0 на колонці з охолоджуючим кожухом розміром 1,5х50 см із швидкістю 0,12 мл/хв. Для запобігання втрат металів, зв'язаних з білками, в елюент не додавали ЕДТА.
Вимірювали світлопоглинання проб при довжині хвилі 280 і 254 нм (D280 і D254). Калібровку колонок здійснювали за допомогою білків з відомою молекулярною масою - сивороткового альбуміну (67,0 кДа), міоглобіну (16,9 кДа) цитохрому с (12,3 кДа) та інсуліну (5,8 кДа) (всі маркери фірми "Sigma", США). Молекулярну масу продуктів елюції визначали також за формулою lgM=5,624-0,752(Ve/V0) [32]. МТ ідентифікували як ТБ із високим показником співвідношення світлопоглинання D254/D280 [18, 235, 384]. Відносний вміст кожної фракції визначали гравіметрично. Знімали УФ спектри фракцій білків. Об'єднані елюати кожної фракції використовували для визначення вмісту металів.
2.2.2. Й о н о о б м і н н а х р о м а т о г р а ф і я ф р а к ц і й Т Б. Фракції ТБ печінки коропа і травної залози беззубки, одержані в результаті гель-хроматографії на сефадексі G-75, досліджували за допомогою йоно-обмінної хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі.
Відразу після гель-хроматографії об'єднані елюати фракції ТБ, одержані з 1 г тканини, концентрували в діалізному мішку ("Serva"), поміщеному у силікагель. Після дворазового зменшення об'єму пробу наносили на йонообмінну хроматографічну колонку 50 х 1,5 см з охолоджуючим кожухом, заповнену аніонітом ДЕАЕ-целюлоза ("Pharmacia"). Для видалення незв'язаних білків колонку промивали 100 мл 10 мМ трис-HCl буферу рН 8,0. Після цього білки елюювали розчином NaCl з лінійним градієнтом концентрації 0 - 1 М в трис-HCl буфері в загальному об'ємі 400 мл. Об'єм проб становив 5 мл, швидкість елюції - 0,5 мл/хв [252]. Оптичну густину елюату реєстрували при 254 і 280 нм. Вимірювали УФ-спектри фракцій. Проби кожної фракції об'єднувались і досліджувались на вміст металів.
2.2.3. Е л е к т р о ф о р е з Т Б. Електрофорез ТБ здійснювали в поліакриламідному гелі в денатуруючих умовах з додецилсульфатом Na (ДСН) за методом Леммлі [25, 316