РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Обґрунтування напрямку досліджень.
Сироватка неімунізованих тварин і людини містить базовий титр ауто- та ксенореактивних антитіл, так званих природних. У літературі до назви природних антитіл використовують, як синонім, термін "поліреактивні антитіла", заснований на їхній здатності специфічно зв'язуватися не з одним, а з декількома структурно неподібними антигенами.
Продуцентами поліреактивних антитіл в організмі людини є лімфоцити В1 субпопуляції, характерною ознакою яких є експресія маркеру поверхні клітин CD5. Рівень лімфоцитів цієї субпопуляції зростає під час різного роду процесів запалення, автоімунних хвороб, злоякісного процесу, тощо. Велике значення при перебігу цих хвороб мають міграція клітин та їх адгезія до позаклітинного матриксу та інших клітин.
Проліферація, міграція фібробластів і секреція ними компонентів ЕЦМ є визначальною у процесах неоваскуляризації, грануляції ран, регенерації тканин, а в разі їхньої злоякісної трансформації - відриву від первинної пухлини та метастазування у органі-мішені. Зростання рівня CD5-позитивних В-лімфоцитів під час запалень, інфекцій та злоякісного процесу дає змогу припустити можливість участі продукованих ними поліреактивних антитіл у регуляції цих патологій, в тому числі через модуляцію поведінки фібробластів.
Метою нашої роботи стало з'ясування можливої участі поліреактивних антитіл у регуляції адгезивних властивостей та міграційної активності фібробластів. На досягнення цієї мети було взято та охарактеризовано моноклональні поліреактивні антитіла клону 2С3, перевірено їхній вплив на проліферативну активність фібробластів, силу адгезивної взаємодії із субстратом нормальних і малігнізованих фібробластів, їхню міграційну активність. Через порівняння з дією ефекторів модулювання адгезії та міграції, механізми реалізації впливу яких з'ясовані, було досліджено можливий механізм зміни названих параметрів поведінки фібробластів під дією поліреактивних антитіл.
Усі експерименти повторювали не менш, ніж 3 рази, кількість паралельних на одну точку брали не менш, чим 2. Обробку даних (обчислення середніх значень та стандартного відхилення) та побудову графіків виконували за допомогою пакету програм Prizm 3.0. Статистичну достовірність відмінності величин обчислювали за t-тестом Ст'юдента за допомогою пакету програм Prizm 3.0.
У всіх експериментах з вивчення як адгезії, так і міграції клітин контрольні, поліреактивні та антиінтегринові антитіла вносили у комірки одночасно із суспензією клітин. Як контрольні використовували імуноглобуліни G миші ("Coulter immunology", Кат. № 6602398), продуковані клітинною лінією МОРС21.
Очищені за допомогою високоефективної рідинної хроматографії фібронектин та урокіназа були люб'язно надані Oxford Bioresearch Laboratory, Oxford, UK. Колаген І типу був одержаний із хвостів щурів здобувачем.
2.2. Очистка та характеристика моноклональних поліреактивних антитіл.
Дослідження впливу природних або поліреактивних антитіл на проліферацію фібробластів, силу адгезивної взаємодії із субстратом нормальних і малігнізованих фібробластів та їхню міграційну активність провадили на прикладі моноклональних антитіл клону 2С3. Сироваткові поліреактивні антитіла являють собою гетерогенну по специфічностям та афінності до різних антигенів популяцію антитіл, що, з урахуванням їх поліреактивності, зробило б конкретизацію їх місць зв'язування на клітинах важкою задачею. Очищення таких антитіл з сироватки тварин також є непростою задачею, оскільки вони досить низькоафінні та, як правило, знаходяться у сироватці у вигляді імунних комплексів. Крім того, було б важко видалити моноспецифічні антитіла, які зазвичай присутні у сироватці навіть неімунізованих тварин. Враховуючи вищесказане, за модель було обрано саме моноклональні поліреактивні антитіла.
2.2.1. Афінне очищення моноклональних антитіл.
Як оптимальна для очищення антитіл як сироваткових, так і моноклональних, насьогодні усталилася методика афінної хроматографії. Моноклональні антитіла вилучали із супернатанту гібридоми 2С3 на афінній колонці з імобілізованим на сефарозі 4В білком G стафілококу ("Pharmacia"). Колонку врівноважували ЗФР (0.01М КН2РО4, 0.15М NaCl, pH 7.2-7.4), наносили супернатант, відмивали ЗФР доки не перестануть сходити з колонки неспецифічні білки та елюювали 0.1М гліцин-HCl буфером, pH 2.7. Вихід білку контролювали за допомогою проточного спектрофотометру Uvicord S ("LKB", модель 2138). рН елюату негайно нейтралізували до значень 7.2-7.4 1М розчином трису, рН 9.0. Кількість білку оцінювали за коефіцієнтом екстинкції, рівного для IgG 1.5.
2.2.2 . Імуноферментний аналіз.
Візуалізація реакції антиген-антитіло за допомогою ковалентно зв'язаних з імуноглобуліном ферментів, на відміну від стандартних реакцій преципітації, дає змогу оцінити активність навіть мікрокількостей реагентів. Порівняно з близьким до імуноферментного аналізу (ІФА) за можливостями радіоімунним методом, ІФА є значно безпечнішим і, через те, легким і простим у користуванні.
Розчин білку в 0.05 М карбонатному буфері, рН 9.6, інкубували в комірках планшету для імуноферментного аналізу протягом ночі при 4оС. Потому розчин білку видаляли, комірки тричі промивали ТФБ (ЗФР + 0.05% Tween-20) і вносили розчин дослідних антитіл у ТФБ. По двогодинній інкубації при 37оС розчин відбирали, комірки тричі промивали ТФБ і додавали розчин антитіл до імуноглобулінів G миші, зкон'югованих з пероксидазою хрону. По двогодинній інкубації при 37оС розчин видаляли, комірки тричі промивали ТФБ і вносили 0.05 М фосфатний буфер з вмістом 0.01% перекису водню та 0.4 мг/мл орто-фенилендиаміну. По досягненні певної інтенсивності забарвлення реакцію зупиняли додаванням 4 н розчину сірчаної кислоти та фотометрували за довжини хвилі 492 нм на фотометрі "Dynatech" MR580.
2.2.3 . SDS-електрофорез білків у 7% поліакриламідному гелі.
На сьогодні стандартною процедурою