РОЗДІЛ 2.
ПРОГРАМА, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.
Загальноклінічне, спеціальне і лабораторне дослідження 268 хворих хронічним простатитом проводилось на клінічних базах кафедри шкірних та венеричних хвороб НМУ (шкірно-венерологічне відділення ЦМКЛ м. Києва, Київському міському шкірно-венерологічному диспансері) та, частково, в науково-дослідному лабораторному центрі (НДЛЦ) НМУ.
Частині хворих (138 пацієнтів) хронічним простатитом, які знаходились під нашим наглядом, проводилось обстеження стану загального і місцевого імунітету. При цьому пацієнти були розподілені на дві групи. Перша, основна група хворих отримувала комплексне лікування по запропонованій нами оригінальній методиці, а друга проходила курс загальноприйнятої терапії.
Імунологічне дослідження місцевого імунітету проводилось в обох групах до початку лікування і після його закінчення. Об(єктом для імунологічного дослідження являвся секрет передміхурової залози, в якому проводилось вивчення вмісту секреторного імуноглобуліну ізотипу А, вмісту і активності лізоциму, а також бактерицидної активності секрету простати.
Статистична обробка цифрових даних виконувалась по Спирмену, методом крапчатого аналізу Шифера і за допомогою критеріїв Ст(юдента.
Імунологічне обстеження включало:
1. Кількісну оцінку стану Т- і В-ланок системи імунітету за допомогою реакцій Е-РОК, М-РОК . Теор-Е-РОК, Теоr.-Е-РОК з еритроцитами барана, згідно рекомендацій .
2. Оцінку АЗКОЦ, вивчення концентрації циркулюючих імунних комплексів проводили згідно загальноприйнятим методикам.
4. Дослідження вмісту аутоантитіл до компонентів тканини простати, згідно рекомендацій [199].
5. Визначення клітинної аутосенсибілізації до антигенів простати [41].
6. Оцінку кисневозалежного метаболізму фагоцитів методом хемілюмінометрії в крові і секреті простати [231].
7. Визначення антитіл G,M,A в крові і секреторного імуноглобуліну А в секреті простати.
8. Визначення бактерицидної активності секрету простати [74].
9. Визначення імуносупресивної активності секрету простати.
10. Оцінку активності лізоциму в секреті простати [197].
За допомогою біохімічних методів оцінювали:
1. Вміст жирних кислот в секреті простати [35].
2. Рівень вільнорадикальних процесів в сироватці крові і секреті простати [41].
3. Антиоксидантну стійкість в сироватці крові і секреті простати [162].
4. Феномен кристалізації секрету простати [145].
5. Визначення вмісту Са, фруктози і лимонної кислоти.
6. Дослідження вмісту фосфатів в крові, сечі, секреті простати.
Постановку реакцій розеткоутворення проводили згідно наступної методики. Кров для дослідження відбирали у пацієнтів натще із кубітальної вени в об'ємі 3 мл в пробірки з гепаріном і 2 мл в пробірки без гепарину для отримання сироватки. Лімфоцити виділяли стандартним методом, шляхом центрифугуваня в градієнті щільності фікол-уротрасту 1.077 г/см3 . Реакцію Е-розеткоутворення проводили за методом Jondal et al. (1972), визначення Е-теофілінрезистентних і Е-теофілінчутливих РОК з еритроцитами барана. Оцінку вмісту В-клітин проводили з використанням еритроцитів. Визначення абсолютної кількості РОК проводили за формулою: РОК тис/мкл=L тис/мкл х РОК%/ 100%.
Визначення АЗКОЦ проводили за наступним методом . Для цього 1 мл завису еритроцитів барана і 0,1 мл завису мононуклеарних клітин крові хворого вносили в плоскодонні пробірки в концентрації, забезпечуючи співвідношення лімфоцит/клітина- мішень 1:50. У другій серії пробірок еритроцити попередньо інкубували із сенсибілізуючою системою, що містила субоптимальну кількість (1мкл) кролячих антитіл проти еритроцитів барана. Всі пробірки інкубували 4 години при температурі 37оС, а потім 10 годин при 4оС. Після інкубації проби центрифугували, до супернатанту добавляли 0,2 мл/ 1% розчину метолу (фоточутливий реактив) і 0.2 мл 3% розчину гідроген пероксиду. Оптичну щільність проб оцінювали на спектрофотометрі СФ-16 при подовженості хвилів 490 нм. АЗКОЦ клітин визначали за формулою:
АЗКОЦ= Ек-Ео х 100%
Ек
де Ео- оптична щільність супернатантів культури клітин, вміщуючих ефекторні клітини і сенсибілізовані еритроцити, а Ек-оптична щільність супернатантів культури клітин.
Рівень ЦІК в сироватці крові визначали шляхом осадження їх поліетіленгліколем з молекулярною масою 6000 (фірма Loba Chemie, Австрія), за методом [236]. Підрахунок результатів проводили на спектрофотометрі СФ-16 в одиницях екстенції.
Титр циркулюючих аутоантитіл визначали в реакції пасивної гемаглютинації із-водно-солевим екстрактом антигенів тканини простати за методом Бойдена в модифікації [199]. Антигени отримували шляхом гомогенізації тканини здорової простати (отриманої від донора, загинувшого внаслідок трагічного випадку) в охолодженому розчині 0,9% хлориду натрію. Клітинну суспензію 4-разово піддавали заморожуванню і розмороженню при +20-70оС , а потім повільному розмороженню при кімнатній температурі. Ступінь зруйнованості клітин контролювали під мікроскопом. Центрифугували завис при 1000 обертів у хвилину на протязі 10 хвилин і відділяли супернатант, вміщуючий антиген. В супернатанті визначали рівень білку за методом Лоурі і доводили його концентрацію до 10 мкг/мл. Приготовлений антиген використовували в реакції пасивної аглютинації з танізированими еритроцитами барана для визначення циркулюючих в крові хворих антитіл. Титр аутоантитіл висловлювали в умовних одиницях.
Дослідження хемілюмінесценції фагоцитів проводили за допомогою люмінолзалежних, ініційованої зимозаном хемілюмінесценції [231]. Люмінол додавали по 0,1 мл (10-М) в проби цільної крові або до секрету простати, розбавленим розчином Хенкса без індикатора (рН 7,4) в 1:20 і 1:5 раз, відповідно. Інкубували в біостаті 15 хвилин і додавали опсонізирований зимозан. Опсонізацію зимозана проводили шляхом інкубації 10 мг попередньо відлитих частин із 3 мл пула сировато