РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНІ МЕТОДИКИ ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Мета та завдання досліджень
Як зазначалося раніше в огляді літератури, основна увага досліджень була
сконцентрована на:
* вивченні біологічної ролі та можливих молекулярно-біохімічних механізмів
впливу кожної із основних форм вуглекислоти (рСО2 і НСО3–) на обмін речовин у
тварин за умов їх природного і штучного гіпобіозу (у динаміці розвитку,
підтримання та виходу з нього);
* розробці та обґрунтуванні біохімічних механізмів щодо способів практичного
застосування явища гіпобіозу у вирішенні деяких проблем медицини та
тваринництва.
Для досягнення основної мети необхідно було вирішити такі завдання:
* вивчити особливості змін концентрацій СО2, О2, бікарбонатів і Н+ у крові
тварин у стані природного гіпобіотичного бауту (в динаміці етапів його
розвитку, підтримання та виходу) та встановити зв’язок виявлених змін з
характерними особливостями обмінних процесів і температури тіла за вищевказаних
умов;
* з’ясувати особливості окисно-відновного стану та його ролі у регуляції обміну
речовин у гепатоцитах ховрахів у динаміці їх гіпобіотичного бауту;
* визначити особливості протікання процесів утилізації вуглекислоти та вивчення
їх можливої ролі в регуляції енергетичного і азотового обмінів та
теплопродукції в тканинах тварин за умов їх природного та штучного гіпобіозу;
* дослідити вплив зміни кислотно-основної рівноваги крові тварин на процеси їх
входження в стан штучного гіпобіозу;
* встановити оптимальні концентрації СО2, НСО3– і Н+ у живильних середовищах
для сперми бугаїв з метою переведення сперміїв у стан гіпобіозу, а також
виявити особливості впливу модифікації живильних середовищ на енергетичний
обмін та на здатність сперміїв до зберігання і запліднення;
* розробити способи переведення риб у стан штучного гіпобіозу, а також вивчити
дію цього явища на стан енергетичного й азотового обміну та термін їх
життєдіяльності за вказаних умов;
* дати біохімічне й клінічне обґрунтування способу застосування явища штучного
гіпобіозу у тварин для загального знеболення та запобігання крововтратам при
хірургічних втручаннях в організм.
У процесі виконання наведених досліджень використовували такі методи:
* визначення рівнів СО2, НСО3–, рО2 і Н+ у крові піддослідних тварин (щури,
ховрахи, коропи);
* розрахунок окисно-відновного стану в компартментах клітин печінки
піддослідних тварин за методом Г. Кребса;
* радіоізотопні (С14) дослідження інтенсивності утилізації вуглецю вуглекислоти
в органічні сполуки тканин тварин;
* спектрофотометричне визначення активності окисно-відновних ферментів та
концентрацій їх окислених і відновлених субстратів у тканинах;
* визначення концентрацій показників азотного і енергетичного обмінів та рівня
вільних радикалів у тканинах;
* ряд методик клінічних та господарських досліджень.
2.2. Відбір матеріалу та підготування його для досліджень
Відповідно до поставлених завдань та досягнення мети були змодельовані стани
природного і штучного гіпобіозу тварин. Відповідно кожна із моделей мала ряд
досліджуваних серій і підсерій. Так модель природного гіпобіозу тварин мала
перші три серії, а штучного – четверту, п’яту і шосту відповідно.
Перша серія – вивчення молекулярно-біохімічних особливостей змін основних
параметрів кислотно-основної рівноваги (КОР), рівня О2 в крові та температури
тіла ховрахів у динаміці розвитку природного гіпобіотичного бауту.
Матеріали та моделі досліджень. З метою вирішення поставленого завдання
проводили досліди на крапчастих ховрахах (Cittelus suslicus Gueld), масою 150 –
200г, яких відловлювали в степу Херсонської області (Асканія-Нова) протягом
літнього періоду (червень – липень). Далі тварин утримували в умовах віварію
Національного аграрного університету. Для годівлі використовували
зерново-овочевий раціон. До середини вересня вони перебували в активному стані,
а потім їх переносили у напівпідвальне приміщення з температурою 10 – 12 єС із
переведенням на сухі корми (зерно, сухарі, насіння соняшнику тощо).
У середині жовтня – на початку листопада, у міру зниження температури
навколишнього середовища до 5 – 7 єС, тварини починали переходити в стан
зимової сплячки. В такому стані вони перебували протягом трьох – чотирьох
місяців. Характерними показниками стану сплячки було зниження температури тіла
тварин до 6 – 8 єС, а частоти серцевих скорочень – до 10 – 15 за 1 хв. Тварини
перебували в характерній позі для стану сплячки і практично не реагували на
больові подразнення (дослідна група) (рис. 2.1).
Протягом сплячки гібернуючі тварини пробуджувалися через кожні 8 – 10 днів (з
нормалізацією температури тіла та дихання). Через 10 – 20 год вони знову
переходили у гіпобіотичний стан.
Рис. 2.1. Крапчастий ховрах у період активної життєдіяльності та за умов
зимової сплячки
Для біохімічних досліджень тварин забивали шляхом декапітації, швидко відбирали
змішану кров у гепаринізовані капіляри, а також інші тканини для досліджень.
Останні заморожували рідким азотом і зберігали у ньому в посудинах Дьюара.
Відбір проб тканин здійснювали на першому, другому, третьому, шостому, восьмому
і дев’ятому днях з моменту початку гібернаційного бауту. За контроль слугували
тварини, які перебували в активному стані.
Друга серія – вивчення молекулярно-біохімічних особливостей змін величин
окисно-відновного потенціалу в гепатоцитах ховрахів у динаміці розвитку
природного гіпобіотичного бауту.
Матеріали та моделі досліджень. Метод визначення величин окисно-відновного
потенціалу в мітохондріях і цитозолі клітин печінки оснований на визначенні
величин співвідношення окислених та відновлених форм пір