<p>РОЗДІЛ 2<br />МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ<br />2.1. Штами бактерій та плазміди<br />Перелік штамів актиноміцетів та Escherichia coli, що використані в роботі<br />подано в табл.2.1. Як тест-культуру під час вивчення біосинтезу еритроміцину<br />штамами Saccharopolyspora erythraea, спіраміцину штамами Streptomyces<br />ambofaciens, антрациклінів штамами Streptomyces peucetius, а також канаміцину<br />штамами Streptomyces kanamyceticus використали Bacillus mycoides HB2, а<br />біосинтезу ландоміцінів штамами Streptomyces globisporus та Streptomyces<br />cyanogenus - Streptomyces albus CEST113. Список плазмід, використаних у роботі,<br />наведений в табл.2.2. Як вектори для клонування ДНК в актиноміцетах використали<br />плазміди pIJ702 [259], pWHM4[453], pIJ486 [469], pSOK101, pSOK201, pCHZ101<br />[490], pSET152, pOJ260, pOJ446, pKC1218E [94], в E.coli – pUC18/19[482],<br />pBluescript 2KS+/SK+ [73], а також фаговий вектор л-GEM11 [398]. <br />2.2. Середовища та реактиви<br />2.2.1. С е р е д о в и щ а т а у м о в и к у л ь т и в у в а н н я. Для<br />вирощування штамів актиноміцетів використовували повноцінні середовища ПКА-2,<br />СР-6, вівсяне середовище ВС, Беннета, кукурудзяне середовище КС [5,45], R2YE<br />[259], R2T[470], ПТА (пептон-триптозний агар, г/л: триптозний агар - 30, пептон<br />– 4, глюкоза –10), та синтетичні - МС [259] та Чапека [5]. В експериметах із<br />вивчення впливу глюкози на ріст S.peucetius subsp. caesius ATCC27952-2<br />використовували варіант середовища МС з додаванням 1% крохмалю (КМС). Міцелій<br />актиноміцетів для отримання протопластів, а також для виділення сумарної та<br />плазмідної ДНК, вирощували у рідких середовищах YEME, TSB [259] та SGGP[479].<br />Регенерацію протопластів проводили на середовищах R2[259], R2T та R2YE.<br />Cередовище Р [259] використовували для збереження протопластів при –80°С. Для<br />виділення генетичних рекомбінантів у схрещуваннях та визначення генетичних<br />маркерів штамів актиноміцетів <br />Таблиця 2.1<br />Штами Escherichia coli та актиноміцетів, використані в роботі<br /> №<br />Штам<br />Характеристика1)<br />Джерело отримання<br />1.<br />Escherichia coli DH5б<br />(ц80dД(lacZ)M15) recA1<br />endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 supE44 relA1 deoR Д(lacZYA-argF)U169<br />F-. Штам – реципієнт для клонування ДНК<br />Life Technolo-gies [398]<br />2.<br />E. coli KW251supE44 galK2 galT22 metB1 hsdR2 mcrB1 mcrA- argA81::Tn10 recD1014<br />F-. Штам – реципієнт для клонування ДНК<br />Др.Г.Крю-гель, Ін-т природних сполук (Йена,ФРН)<br />3.<br />E.coli ET12567 (pUB307) (dam-13::Tn9(Cmr) dcm-6 hsdM)<br />Несе плазміду pUB307. Штам – донор у <br />кон’югаційних схрещу-ваннях E.coli – Streptomy-ces<br />Проф. К.П. Сміт, Ман-честерcький ун-т (Вели-кобританія)<br />4.<br />Micromonospora purpurea<br />BНИИА 1634<br />Продуцент гентаміцину<br />РНЦА (Мос-ква, Росія)<br />5.<br />M.zionensis ВНИИА 1611<br />Продуцент сизоміцину<br />-“-<br />6.<br />Saccharopolyspora erythraea<br />NRLL2338<br />Продуцент еритроміцину<br />-“-<br />7.<br />Sacch. erythraea 5<br />-“-<br />-“-<br />8.<br />Sacch. erythraea 3<br />-“-<br />-“-<br />9.<br />Sacch. erythraea BTCC2<br />-“-<br />Др.Т.Тодо-ров, Ін-т мікробіології БАН (Софія)<br />10.<br />5001 met1 eryA1<br />Мутант Met- Ery- ВТСС2<br />-“-<br />11.<br />5002 met1 eryD2<br />-“-<br />-“-<br />5003 met1 arg1 eryC3<br />Мутант Met- Arg- Ery- ВТСС2<br />-“-<br />12.<br />2215 eryB1<br />Мутант Ery- ВТСС2<br />-“-<br />13.<br />1346 ura1 leu1<br />Мутант Ura- Leu- ВТСС2<br />-“-<br />14.<br />2407 met1 trp3 phe1<br />Мутант Met- Trp- Phe-ВТСС2<br />-“-<br />15.<br />4608 ura1 leu1 thy1<br />Мутант Ura- Leu- Thy-ВТСС2<br />-“- <br />16.<br />1346 ura1 leu1 rifR5<br />Мутант RifR штама 1346<br />Отриманий в роботі<br />Продовження таблиці 2.1.<br />17.<br />2407 met1 trp3 phe1 rif8<br />Мутант RifR штама 2407<br />Отриманий в роботі<br />18.<br />2407 met1 trp3 phe1 cmlR45<br />Мутант CmlR штама 2407<br />19.<br />rifR21<br />Мутант RifR штама 3<br />-“-<br />20.<br />rifR261<br />Мутант RifR штама 5<br />-“-<br />21.<br />rifR320<br />-“-<br />-“-<br />22.<br />rifR621<br />-“-<br />-“-<br />23.<br />rifR1020<br />-“-<br />-“-<br />24.<br />cmlR9<br />Мутант CmlR штама 5<br />-“-<br />25.<br />cmlR12<br />-“-<br />-“-<br />26.<br />cmlR19<br />-“-<br />-“-<br />27.<br />cmlR23<br />-“-<br />-“-<br />28.<br />cmlR24<br />-“-<br />-“-<br />29.<br />cmlR32<br />-“-<br />-“-<br />30<br />cmlR45<br />-“-<br />-“-<br />31.<br />cmlR320<br />-“-<br />-“-<br />32.<br /> cmlR39<br />-“-<br />-“-<br />33.<br />cmlR322<br />-“-<br />-“-<br />34.<br />cmlR390<br />-“-<br />-“-<br />35.<br />cmlR391<br />-“-<br />-“-<br />36.<br />cmlS12<br />Мутант CmlS штама 5<br />-“-<br />37.<br />tsrR101<br />Мутант TsrR штама 5<br />-“-<br />38.<br />tsrR102<br />-“-<br />-“-<br />39.<br />tsrR105<br />-“-<br />-“-<br />40.<br />tsrR155<br />-“-<br />-“-<br />41.<br />tsrR523<br />-“-<br />-“-<br />42.<br />strR31<br />Мутант StrR штама 3<br />-“-<br />43.<br />strR120<br />Мутант StrR штама 5<br />-“-<br />44.<br />strR155<br />-“-<br />-“-<br />45.<br />strR1034<br />-“-<br />-“-<br />46.<br />strR1031<br />-“-<br />-“-<br />47.<br />strR3005<br />-“-<br />-“-<br />48.<br />strR3015<br />-“-<br />-“-<br />49.<br />strR148<br />-“-<br />-“-<br />50.<br />strR1448<br />-“-<br />-“-<br />51.<br />strR141<br />-“-<br />-“-<br />52.<br />strR1033<br />-“-<br />-“-<br />53.<br />strR1024<br />-“-<br />-“-<br />Продовження таблиці 2.1<br />54.<br />Streptomyces albus CEST113<br />проф.Х.Са-лас, Універ-ситет Ов’є-до (Іспанія)<br />55.<br />S.ambofaciens ВНИИА1115<br />Продуцент спіраміцину<br />РНЦА (Москва, Росія)<br />56.<br />cmlS1<br />Мутант CmlS штама 1115<br />Отриманий в роботі<br />57.<br />cmlS2<br />-“-<br />-“-<br />58.<br />cmlS3<br />-“-<br />-“-<br />59.<br />cmlR11<br />Мутант CmlR штама 1115<br />-“-<br />60.<br />cmlR30<br />-“-<br />-“-<br />61.<br />cmlR45<br />-“-<br />-“-<br />62.<br />ermR5<br />Мутант ErmR штама 1115<br />-“-<br />63.<br />S.ambofaciens ВНИИА792<br />Продуцент спіраміцину<br />РНЦА (Москва, Росія)<br />64.<br />ermR60<br />Мутант ErmR штама 792<br />Отриманий в роботі<br />65.<br />strR1<br />Мутант StrR штама 792<br />-“-<br />66.<br />S.antibioticus OL71<br />Продуцент олеандоміцину<br />РНЦА (Москва, Росія)<br />67.<br />S.aureofaciens 019(8)<br />Продуцент хлортетрацик-ліну<br />-“-<br />68.<br />S.caespitosus IMET43411<br />Продуцент мітоміцину С<br />Др.Г.Крю-гель, Ін-т природних сполук (Йена,ФРН)<br />69.<br />S.coelicolor A3(2) S18 cysD18 adeC(V10) strA1 <br />Cys- Ade- StrR<br />SCP1-SCP2-<br />ДНДІ гене-тики (Мос-ква, Росія)<br />70.<br />S.coelicolor A3(2) А617 pabA1 uraA1 argA1 strA1 <br />Pab- Ura- Arg- StrR SCP1+SCP2+<br />-“-<br />71.<br />S.coelicolor A3(2) M130<br />hisA1 uraA1 strA1<br />His- Ura- StrR <br />SCP1-SCP2-<br />Проф. К.Че-тер, Центр Джона Ін-неса (Но-рідж, Вели-кобританія) <br />Продовження таблиці 2.1 <br />72.<br />S.coelicolor A3(2) M138<br />argA1 proA1 cysD18<br />Arg- Pro- Cys- SCP1+SCP2-<br />Проф. К.Че-тер, Центр Джона Інне-са (Норідж, Великобри-танія)<br />73.<br />cmlS507<br />Мутант CmlS ш</p>
- Київ+380960830922