РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для досягнення поставленої мети дослідження нами проведено ретроспективний
аналіз за період 1998 – 2003 роки гінекологічної захворюваності у 19260
дівчаток і підлітків Буковини за звітними статистичними даними обласного
управління охорони здоров’я в Чернівецькій області. В усій групі 8330 дівчат
знаходились на диспансерному обліку з приводу запальних захворювань геніталій,
а серед них - 5792 дівчаток та підлітків перебували на обліку з приводу
запальних захворювань зовнішніх статевих органів та піхви.
Нами комплексно за допомогою клінічних, мікробіологічних, цитологічних,
імуноцитохімічних, полімеразної ланцюгової реакції, імунофлюоресцентного
методів дослідження матеріалу з піхви дівчаток та підлітків та імуноферментного
аналізу показників загального, місцевого імунітету, цитокінового статусу
обстежено 441 хвору на запальні захворювання зовнішніх статевих органів та
піхви усіх вікових періодів життя і 54 дівчини, відповідно усіх періодів, які
склали контрольну групу дослідження. Крім цього, вивчено мікробіоценоз піхви у
48 новонароджених дівчаток з моменту народження та протягом перших 48 годин
життя від матерів з екстрагенітальною патологією.
Обстеження дівчат обох груп проводилось на клінічній базі кафедри акушерства і
гінекології з курсом дитячої та підліткової гінекології БДМУ у Чернівецькому
міському пологовому будинку №1, Чернівецькій міській дитячій поліклініці,
Чернівецькій обласній дитячій лікарні №2, Чернівецькому обласному медичному
діагностичному центрі, кафедрі клінічної імунології, алергології та
ендокринології БДМУ, ІПАГ АМН України.
Оцінка мікробіоценозу піхви проводилась комплексно за допомогою ряду
мікробіологічних та мікроскопічних досліджень.
Цитологічний метод Романовського – Гімза включав взяття виділень із присінку
піхви для досліджень стерильним ватним тампоном і взятий матеріал наносили на
скельце. Тривалість забарвлення залежала від температури повітря в приміщенні і
тривала від 25 до 45 хв.
Морфометричний метод дав змогу провести підрахунок клітин з дистрофічними
змінами (жирова та гідропічна дистрофії) в перерахунку на 100 клітин; для
характеристики запальної інфільтрації - провести підрахунок клітин
(нейтрофілів, лімфоцитів та макрофагів).
Імунофлюоресцентне дослідження інфекційних агентів проводилось шляхом
використання діагностичних антитіл: “Хламі-Скан” – для виявлення антигенів
Chlamidia trachomatis; “Герпес-Скан” для виявлення вірусу простого герпесу;
“Міко-Скан” – для виявлення антигенів Mycoplasma hominis; “Уреа-Скан” – для
виявлення антигенів Ureaplasma urealyticum.
Полімеразна ланцюгова реакція є діагностичним методом, що дозволяє виявити
одиничні клітини збудника багатьох інфекційних хвороб за рахунок багатократного
збільшення кількості копій тестуючих специфічних послідовностей ДНК. Для того,
щоб здійснити такий процес у пробірці, використовують дві генетичні проби, що
називаються праймерами, які служать як затравки для синтезу обраної ділянки
ДНК. При внесенні в досліджувану пробу праймери, подібно парі генетичних
“детективів”, “прочісують” розчин у пошуках ділянки, якій вони комплементарні
і, відповідно, здатні приєднатися, утворюючи двонитчасту стартову ділянку.
Після приєднання праймерів за допомогою фермента – Таg-полімерази починається
відтворення специфічного фрагменту ДНК. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать
як матриці для синтезу нових ниток у наступному циклі ампліфікації – це і є
ланцюгова реакція в ПЛР.
У результаті кількість копій фрагменту збільшується в геометричній прогресії,
і, через 25 циклів ампліфікації синтезується 106 копій фрагменту. Протягом
30-40 циклів утворюється достатня кількість ДНК, щоб візуально врахувати
результати реакції після електрофорезу в агарозному гелі.
Мікробіологічне обстеження включало мікроскопію, бактеріологічне та мікологічне
дослідження вмісту заднього склепіння піхви, який забирали спеціальними
тампонами. Мікропрепарати фарбували за методами Грам-Синьова,
Гімзе-Романовського та метиленовим синім і мікроскопували в імерсійному
мікроскопі.
Визначали наявність різних за періодом розвитку форм Trichomonas vaginalis та
морфологічні особливості анаеробних й аеробних грампозитивних та грамнегативних
бактерій і дріжджоподібних грибів роду Candida.
Бактеріологічним методом виділяли та ідентифікували бактеріальні форми
мікроорганізмів. Для виділення аеробних бактерій (Staphylococcus, Neisseria,
Enterobacteriaceae, Corynebacterium), матеріал засівали на селективні поживні
середовища й інкубували при температурі 370С в термостаті протягом 1-2 діб,
отримували ізольовані колонії, а із них - чисті культури, які ідентифікували за
морфологічними, тинкторіальними, культуральними та біохімічними властивостями.
Анаеробні бактерії (Bifidobacterium) вирощували на відповідних середовищах у
стаціонарному анаеростаті СО2-incubator Т-125 фірми ASSAB Medium (Швеція)
протягом 5-7 днів (іноді до 14 діб). Ідентифікацію анаеробних бактерій
здійснювали за відповідним методом (Берг), показник рH піхвового середовища
вимірювали за допомогою індикатора рH фірми Merk Sharp and Dohme (США).
Мікроекологічні показники видового складу визначали за методом М.Бигон та
співавт. (1989).
Імуноцитохімічні методи включали: непрямий стрептовідин-пероксидазний метод
виявлення рецептора CD-95 Apo-1/Fas (фірма DAKO, Данія). Дана методика визначає
ступінь експресії СD-95 антигену апоптоза Apo-1 або Fas антигену з молекулярною
масою 45 кД, трансмембранна молекула типа І, належить до суперсімейства
рецепторів фактора некрозу пухлин, визначає сигнали, що індукує апоптоз.
- Київ+380960830922