Содержание
Введение
ГЛАВА 1. ЯМР-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ И ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ (литературный обзор)
1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса
1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига
1.3. Вращение образца под магическим углом
1.4. Двумерные обменные ЯМР-экспсрименты
1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты
1.6. ЯМР-рслаксация
1.7. Корреляционная функция молекулярного движения и безмодельный подход
1.8. ЯМР и химический обмен в белковых растворах
1.9. Особенности проведения ЯМР-экспериментов на различных магнитных ядрах
1.10. Конформационная динамика белков
1.10.1. Белки в растворе
1.10.2. Белки в твердом состоянии
1.10.3. Обобщающие замечания
ГЛАВА 2. БРОУНОВСКАЯ ДИНАМИКА И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ
2.1. Качественная модель межмолекулярных
электростатических взаимодействий
2.2. ЯМР-релаксациоиные эксперименты на протонах белков
в растворах тяжелой воды
2.2.1. Методы измерения и анализа времен релаксации
2.2.2. Результаты экспериментов и их обсуждение
2.3. Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах
белков
2.4. Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина
2.5. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей
2.6. Заключение ко второй главе 118
ГЛАВА 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРЕННИХ КОНФОРМАЦИОННЫХ ДВИЖЕНИЙ БЕЛКОВ И ПОЛИПЕПТИДОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ 120
3.1. Расширение частотного диапазона твердотельного ЯМР-
эксперимента по релаксации во вращающейся системе координат для случая гетероядерной дипольной релаксации 120
3.1.1. Использование отстройки от резонанса частоты
поля сп ин-лока 122
3.1.2. Использование дипольной развязки от протонов во время действия спин-лока 129
3.2. Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях 134
3.2.1. Постановка задачи 134
3.2.2. Условия эксперимента 136
3.2.3. Результаты и обсуждение 137
3.3. Исследование динамики биополимеров с помощью ЯМР-
релаксации на ядрах *Н и ,3С естественного содержания 144
3.3.1. Полилизин - релаксация на ядрах13 С
естественного содержания 144
З.ЗАА. Условия эксперимента и методы анализа 145
3.3.1.2. Динамика боковых цепей 15 0
3.3.1.3. Динамика основной цепи 155
З.ЗАА. Выводы 156
3.3.2. Сравнительный анализ динамики полилизина и лизоцима по данным релаксации на ядрах 13С естественного содержания 15 8
3.3.2.1. Результаты 15 8
3.3.2.2. Обсуждение 161
3.3.3. Полилизин - сравнительный анализ ЯМР-релаксации на ядрах 1Н и13С 166
3.3.3.1. Преимущества и особенности сравнительного анализа ЯМР-релаксации на ядрах ]Н и 13С в биополимерах 167
3.3.3.2. Условия эксперимента и методы анализа. 168
3.3.3.3. Результаты и обсуждение 173
3
3.4. Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопин для исследования низкочастотной внутренней динамики белков 187
3.4.1. Исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина с помощью последовательности tr-ODESSA 187
3.4.1.1. Условия эксперимента и результаты 187
3.4.1.2. Спиновая диффузия 191
3.4.1.3. Молекулярное движение основной цепи барстара 197
3.4.2. Совместный анализ обменных и релаксационных ЯМР-данных - метод SREDA 200
3.4.2.1. Условия эксперимента 201
3.4.2.2. Математическое описание метода SREDA. 203
3.4.2.3. Результаты и обсуждение 206
3.4.3. Эффект зависимости скорости спиновой
д иффуз и и между ядрам и15N от частоты ВЫ У 215
Основные выводы и результаты 224
Благодарности 228
Ссылки 229
4
Введение
Наряду с ДНК белки являются основными биологическими макромолекулами, благодаря которым на Земле существует жизнь во всех ее формах. Они выполняют множество важных для живых организмов функций - транспортных, ферментативных, регуляторных, механохимических и других. Белок представляет собой длинную одномерную полимерную цепь, состоящую из звеньев -аминокислот. Всего существует 20 различных типов природных аминокислот, которые различаются друг от друга химическим строением боковой цепи. Длина полипептидной цепи для различных белков варьируется от 30-40 до многих сотен и даже тысяч аминокислот. Принципиально важным отличием белков от
синтетических полимеров является то, что каждый белок имеет свою уникальную нативную конформацию, то есть пространственную укладку полипептидной цепи, благодаря которой белок способен выполнять свою биологическую функцию. Эта конформация закодирована в первичной структуре белка, т.е. в последовательности аминокислот. В качестве примера на рисунке слева изображена структура основной цепи одного из глобулярных белков, лизоцима фагаТ4.
За последние десятилетия белки стали едва ли не самым популярным биологическим объектом, который интенсивно изучается физическими методами. Основная цель исследования белков - это изучение молекулярных механизмов их биологического функционирования. Иными словами, люди пытаются понять, как белок работает. Кроме того, что это интересно само по себе, эти исследования также имеют и сугубо практическое значение: если знать механизм действия белка, его можно модифицировать или придать ему новые функции. А это очень важно для биотехнологии и медицины.
Хотя и очень условно, работы по изучению механизмов функционирования белков можно разделить на два направления. Одно из них - это структурные
Схематическое изображение пространственной структуры основной цепи лизоцима Т4.
5
исследования, другое - изучение молекулярной динамики белков. К настоящему времени не подвергается сомнению, что оба эти фактора крайне важны для понимания молекулярных основ биологической работы белков. Однако исторически сложилось так, что структурные исследования белков начались гораздо раньше, и в этой области науки сделано намного больше, чем в исследованиях по молекулярной динамике. Сильный толчок развитию науки о белках дала первая расшифровка пространственной структуры глобулярного белка (гемоглобина) методом рентгеноструктурного анализа [1], за что в 1962 году Макс Перутц получил Нобелевскую премию. За прошедшее с тех пор время этим методом расшифровано уже много тысяч структур различных белков. Знание пространственной структуры действительно во многом объясняет многие свойства и функциональные возможности белка. Часто это достигается сравнительным анализом структур одного и того же белка в различных биологических состояниях, например, белка дикого типа и мутанта, свободного и связанного с лигандом и т.д. Достижения в структурном анализе обусловили развитие исследований корреляции между первичной и пространственной структурами, что очень важно для понимания механизмов фолдинга (самосборки) белка.
Второй всплеск интереса к структурным исследованиям белков пришелся на конец восьмидесятых - девяностые годы прошлого столетия. Он связан с развитием другого мощного метода определения структуры белков - многомерного и мультиядерного ЯМР высокого разрешения в растворах. За эти работы тоже была присуждена Нобелевская премия, которую в 2002 году получил швейцарец Курт Вютрих [2]. И рентгеноструктурный анализ, и ЯМР обладают своими методическими достоинствами и недостатками, но у ЯМР есть одно важное и бесспорное преимущество: в то время как рентгеноструктурный анализ может работать только в монокристаллах белков, ЯМР определяет пространственную структуру белков непосредственно в водных растворах, то есть в их естественной среде.
Следует отметить, что в природе существует очень широкий класс белков, которые не кристаллизуются и, в то же время, нерастворимы, как, например, большинство мембранных белков. Для определения их структуры наиболее приемлемым методом является ЯМР твердого тела. Но у твердотельного ЯМР есть
6
несколько существенных методических проблем, которые пока не позволяют использовать его в структурных исследованиях белков так же широко, как рентгеноструктурный анализ и жидкостный ЯМР. Тем не менее, в последние годы идет интенсивное развитие методик твердотельного ЯМР, позволяющих соотносить линии в спектрах и определять расстояния, планарные и торсионные углы между магнитными ядрами [3-5]. Не так давно группой Хартмута Ошкината в Германии была расшифрована первая структура белка в твердом состоянии методом ЯМР твердого тела [6]. И не исключено, что через некоторое время мы будем свидетелями очередного бума структурных исследований.
Несмотря на то, что знание пространственного строения полипептидной цепи открывает путь к пониманию очень многих свойств белка, почти сразу же стало ясно, что одной только этой информации недостаточно для полного детального объяснения механизма функционирования белка на молекулярном уровне. Это можно продемонстрировать на примере того же самого гемоглобина. Его биологическая функция состоит в транспортировке кислорода в крови. Молекула кислорода связывается в активном центре белка, геме, и таким образом переносится в нужное место. Детальный анализ пространственной структуры показывает, что щель, соединяющая гем с поверхностью белка, очень узка для молекулы кислорода, и для того, чтобы она сквозь нее "протиснулась", необходимо предположить, что структура белка подвижна. В те моменты, когда щель приоткрывается, гем становится стерически доступным, и тогда возможно связывание белка с молекулой кислорода. Детально роль молекулярной динамики в биологическом функционировании гемоглобина была рассмотрена в серии работ Мартина Карплюса (см. обзор [7] и ссылки в этой работе).
Это один из самых простейших и очевидных, но далеко не самый исчерпывающий пример важности динамики для биологической функции. Механизмы вовлечения молекулярной подвижности в работу белка могут быть весьма замысловатыми и не столь легко объяснимыми. Пока не существует, да, наверное, и не может существовать в принципе, единого рецепта или алгоритма связи тех или иных молекулярно-динамических параметров с той или иной биологической функцией. Это очень специфическая проблема, которая должна анализироваться в каждом конкретном случае по-своему. Молекулярным
7
механизмам вовлечения динамики в биологическую функцию посвящен ряд последних обзоров по динамике белков [8-13].
Кроме внутримолекулярной конформационной динамики белков, о которой шла речь выше, для глобулярных белков в растворе существует еще один, практически независимый от внутренней динамики, тип движения. Это броуновская трансляционная и вращательная диффузия белка как целого. Биологическая роль броуновской динамики более проста и прозрачна - обеспечить пространственное сближение и необходимую ориентацию друг относительно друга белка и его субстрата.
Частотный диапазон колебаний атомов белка очень широк. Характерное время самых быстрых движений - фемтосекунды, самых медленных - секунды и даже минуты. Фемтосекундная область соответствует колебаниям валентных связей и валентных углов. Пикосекундная область и все, что медленнее, обуславливается конформационными степенями свободы структуры белка - двугранными (торсионными) углами ф и ф, обеспечивающими гибкость основной цепи белка, а также двугранными углами х> определяющими конформацию боковых цепей аминокислотных остатков. Колебания этих углов могут быть очень быстрыми, если речь идет о движении отдельных химических групп. Например, характерное время вращения трех метальных протонов вокруг оси симметрии метальной группы при комнатной температуре составляет единицы пикосекунд. Низкоамплитудные некоррелированные колебания отдельных боковых цепей или небольших участков основной цепи в пределах стерических ограничений могут составлять доли и единицы наносекунд. Крупномасштабные конформационные переходы всегда являются высококоррелированными изменениями многих степеней свободы белка, поскольку обычно белки - довольно плотноупакованные структуры, практически без свободного объема внутри глобулы. Сколько-нибудь заметные смещения одного участка структуры белка могут происходить только при согласованном смещении соседних участков. Характерное время внутренней динамики этого типа находится в микро- и миллисекундном диапазонах. Следует отметить, что временной масштаб этой медленной динамики совпадает с временным масштабом многих молекулярнобиологических процессов, например, таких как связывание с субстратом, катализ, фолдинг и т.п. Поэтому вполне естественно предположить, что именно медленная
8
конформационная динамика наиболее значима для биологической функции белка и именно ее изучение представляет наибольший интерес с точки зрения биологии.
Комплекс методов, применявшихся до сих пор для изучения молекулярной динамики белков, включает в себя ЯМР, ЭПР, диэлектрическую, флуоресцентную, инфракрасную и мсссбауэровскую спектроскопии, нейтронное рассеяние, компьютерное моделирование и даже рентгеноструктурный анализ, который дает информацию о т.н. В-факторах, т.е. степени "размазывания" координат атомов в пространстве из-за молекулярной подвижности. Не в обиду будь то сказано специалистам из других областей, однако к настоящему времени стало совершенно очевидно, что для белков самым мощным, самым информативным методом, имеющим самый широкий спектр возможностей, является ЯМР. Для этого есть целый ряд причин, самая главная из которых - это селективность структурной и динамической информации, получаемой с помощью ЯМР. Это обусловлено тем фактом, что магнитные ядра, на которых можно проводить эксперименты, прежде всего, протоны, азоты и углероды, распределены по всей структуре белка. А современные методики ЯМР позволяют, хотя, конечно, и не во всех случаях, различать эти ядра и соотносить их с химической структурой белка. Практически все остальные экспериментальные методы дают информацию о природных зондах, которые либо локализованы только в одном месте белковой глобулы (мессбауэровская спектроскопия, флуоресценция, ЭПР), либо являются интегральной характеристикой всей глобулы, не дающей информации о различных ее частях (диэлектрическая спектроскопия, нейтронное рассеяние). Болес детальную и обширную по сравнению с ЯМР информацию о молекулярной динамике может дать только компьютерное моделирование. Но этот метод только условно может считаться истинно экспериментальным, поскольку все силовые поля, используемые при моделировании таких сложных молекул как белки, являются только приближением.
К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал, характеризующий динамику многих биополимеров в различных состояниях и при различных экспериментальных условиях. Тем не менее, не до конца решенными остаются несколько важных проблем, которые имеют фундаментальное значение для дальнейшего развития этой области научных исследований. В частности, нет
9
ясного общего представления о том, как межбелковые контакты и взаимодействия влияют на динамическое поведение белков. В живой клетке белки находятся в непосредственном окружении других белков и различных (макро)молекул. Очевидно, что вопрос о влиянии межмолекулярных взаимодействий на различные параметры динамики является очень существенным для выяснения молекулярных механизмов биологического функционирования белков.
В растворах очень важным является эффект взаимного электростатического ориентирования биомолекул. Он является ключевым в процессе "докинга" (docking), то есть "причаливания" двух белков (или белка и субстрата) друг к другу. Комплементарные электростатические свойства двух молекул могут на много порядков ускорять процесс нахождения, распознавания и связывания их друг с другом по сравнению с простым механизмом тепловой броуновской диффузии. В то же время, даже если белки в растворе не обладают комплементарной электростатической структурой, их межмолекулярные взаимодействия на относительно длинных расстояниях могут сказываться на характере их броуновской диффузии. До сих пор при анализе различных экспериментальных данных этим эффектом в подавляющем большинстве случаев пренебрегали. Но следует отметить, что без точной информации о вращении белка как целого корректно определить параметры его внутренних движений невозможно.
Остается также открытым вопрос о влиянии межмолекулярных контактов на динамические свойства белков в твердых препаратах. Если вопрос об идентичности структур белков в кристаллах и растворах был в целом благополучно разрешен путем сравнения структур, определенных методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР высокого разрешения [14], то в отношении динамики ясной картины на этот счет нет. Это, кстати говоря, является одной из причин неоднозначного отношения некоторых исследователей к биологической значимости изучения глобулярных белков в твердом состоянии.
Другая проблема - это механизмы влияния гидратной воды на внутреннюю динамику белков. Изучение взаимодействия белков с водой является одним из самых популярных направлений исследований в физике белков, поскольку вода обуславливает их многие биологические свойства. То, что гидратация оказывает значительное влияние на динамические свойства биополимеров, известно очень
10
давно. Но в силу ряда методических причин, которые будут подробно обсуждаться ниже, большинство работ по изучению влияния гидратации на динамику носит качественно-сравнительный характер. Из таких результатов однозначно определить физические факторы и механизмы влияния гидратации на внутреннюю динамику достаточно сложно. Почему на разные биополимеры и на разные параметры динамики гидратная вода влияет по-разному - здесь еще много неясного.
Наконец, еще одна очень важная проблема - это определение физической модели молекулярного движения из экспериментальных данных. Практически любой ЯМР-эксперимснт, ориентированный на изучение молекулярной динамики, позволяет определить только степень усреднения того или иного типа взаимодействия магнитных ядер либо с внешним полем, либо друг с другом (эта степень часто называется параметром порядка, который был введен Липари и Сзабо в рамках так называемого безмодельного подхода [15,16]) и временной масштаб этого усреднения. В подавляющем большинстве случаев эту степень усреднения невозможно однозначно переформулировать в понятные для описания молекулярной динамики параметры - амплитуды движения, выраженные в ангстремах или градусах, стереометрические модели, степень корреляции между движениями различных элементов структуры. Это принципиальное отличие динамических ЯМР-экспериментов от структурных. В последних конечным результатом являются как раз вполне «осязаемые» для определения структуры параметры - межатомные расстояния и различного рода углы. А конечным результатом динамических экспериментов являются некие промежуточные параметры, чувствительные к молекулярной динамике, но связанные с ней неоднозначно.
Кроме того, следует иметь в виду, что сам процесс получения этих промежуточных параметров из эксперимента зачастую неоднозначен. Например, из измерения одного или двух времен релаксации невозможно однозначно определить параметр порядка молекулярного движения и/или времени корреляции. Из формы линии твердотельного спектра, записанного при одной температуре, невозможно однозначно определить параметры реориентации тензора АХС. Для определения этих параметров необходимо или проведение большого числа различных экспериментов, и/или априорное использование той или иной модели.
11
Говоря о медленных конформационных движениях, которые, как мы отметили выше, наиболее интересны с точки зрения биологии, следует упомянуть о еще одной важной методической проблеме, которая существенно усложняет изучение молекулярной динамики этого типа в белковых растворах. Дело в том, что изотропное броуновское вращение белка как целого накладывается на внутреннюю динамику, и все медленные внутренние движения, которые имеют время корреляции длиннее, чем время корреляции броуновского вращения (для большинства белков
о
порядка 10' с), становятся практическими невидимыми для физических методов, регистрирующих механическую реориентацию того или иного природного зонда. В число этих методов попадают ЯМР-релаксация, диэлектрическая и флуоресцентная спектроскопии, ЭПР. Впрочем, ситуация не безнадежна, есть эксперименты, позволяющие регистрировать медленные движения и в растворах. Например, метод водородного обмена, который определяет скорость химического обмена лабильных протонов белка на дейтероны растворителя. Хотя и косвенно, он даст информацию о крупномасштабных конформационных переходах, обеспечивающих контакт молекул растворителя с тем или иным доменом структуры белка. Кроме того, ЯМР позволяет регистрировать медленные движения, если они приводят к изменению изотропного химического сдвига магнитного ядра (эти эксперименты будут более подробно рассмотрены в первой главе). Однако эти методы позволяют только зарегистрировать сам факт наличия медленного движения и оценить его время корреляции. Информация об амплитуде и геометрии движений с помощью этих методов недоступна. Решением проблемы здесь может стать только изучение динамики белков в твердом состоянии, то есть в виде порошков или кристаллов, где броуновское вращение отсутствует. На настоящий момент, область изучения динамики биополимеров с помощью твердотельного ЯМР очень привлекательна тем, что она в гораздо большей степени представляет собой terra incognita по сравнению с жидкостным ЯМР и открывает широкий простор для применения новых нестандартных подходов и решений, особенно в методологии ЯМР-экспериментов. Этим исследованиям посвящается большая часть диссертации.
Основными задачами данной работы являются, во-первых, изучение влияния межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков, как в растворе, так и в твердом состоянии и, во-вторых, разработка способов получения
12
информации о физических моделях динамики биополимеров непосредственно из экспериментальных данных. Диссертация состоит из трех глав. В первой главе дано систематическое изложение основных типов ЯМР-экспериментов и их математического формализма, позволяющих получать информацию о молекулярной динамике. Особое внимание уделено описанию твердотельных одномерных обменных ЯМР-экспериментов с вращением образца под магическим углом. Методика этих экспериментов была разработана совсем недавно и, в отличие от релаксации или анализа формы линии спектра, их пока нельзя причислить к числу рутинных методов исследования молекулярных движений. Поскольку в диссертации этот метод используется в детальном количественном исследовании динамики белков, описание математических основ обменных экспериментов является важной частью первой главы. Кроме того, в первой главе представлен краткий литературный обзор основных направлений исследований динамики белков, как в растворе, так и в твердом состоянии. В этом обзоре описаны основные методические подходы, обобщение ключевых результатов, полученных к настоящему времени, и основные нерешенные проблемы в этой области науки.
Вторая глава посвящена изучению влияния межмолекулярных взаимодействий между белками в растворе на характер их броуновской диффузии и построению модели, адекватно объясняющей наблюдаемые в эксперименте особенности движения белков при различных экспериментальных условиях. Для изучения динамики белков в растворе был применен целый комплекс различных физических методов - ЯМР-релаксация, временная диэлектрическая спектроскопия и компьютерное моделирование динамики броуновских частиц.
Третья глава посвящена изучению внутренней динамики белков и полипептидов в твердом состоянии. Причина проведения экспериментов именно в твердом состоянии была изложена выше. В этой главе было изучено влияние межмолекулярных конта!сгов на внутреннюю динамику нескольких белков, проведено количественное исследование влияния гидратации на динамику полилизина и лизоцима, а также разработано два метода, позволяющих переходить от безмоделыюго подхода в анализе экспериментальных данных к получению реальных физических моделей молекулярной подвижности. Ключевым моментом в наших методах является совместный количественный анализ данных различных
13
ЯМР-экспериментов, проведенных на одном и том же образце. Хотя разработка новых методических подходов не является основной целью диссертации, методические результаты имеют существенное значение, поскольку именно они позволили в результате получить ту информацию о молекулярной динамике, которая была недоступна с помощью стандартных экспериментов.
Работа была выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Все твердотельные ЯМР-эксперименты, представленные в диссертации, были проведены в группе ЯМР-спектроскоиии Университета Мартина-Лютера г. Халле, Германия, в рамках многолетнего сотрудничества между нашими лабораториями. Работа была поддержана рядом инициативных грантов РФФИ и совместных грантов РФФИ и Немецкого Научно-исследовательского Общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft). Результаты диссертации докладывались на многих российских и международных конференциях и были опубликованы в различных рецензируемых журналах.
14
ГЛАВА 1.
ЯМР-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ И ПРИМЕРЫ ИХ
ПРИМЕНЕНИЯ (литературный обзор).
1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике
посредством ядерного магнитного резонанса.
При всем многообразии типов экспериментов и импульсных последовательностей, применяющихся к настоящему времени в ЯМР для получения информации о молекулярных движениях в различных системах, по своему физическому смыслу все они могут быть поделены на три группы по типу природного зонда, по которому можно судить о молекулярной динамике.
В первую группу входят эксперименты, регистрирующие изменение изотропного (т.е. усредненного по всем ориентациям) химического сдвига магнитного ядра. Химический сдвиг зависит не только от химической структуры макромолекулы, но и от ее конформации. Причем, не только конформации участка, на котором непосредственно находится магнитное ядро, но и конформации удаленных по числу ковалентных связей (или первичной структуре, если мы говорим о белках), но близких в пространстве участков. Если конформация биополимера подвижна, и если эти движения приводят к заметному изменению химического сдвига (что, впрочем, совсем не обязательно), то это можно заметить по форме спектра ЯМР и/или по дополнительному так называемому обменному вкладу в скорость поперечной магнитной релаксации.
Вторая группа ЯМР-экспериментов использует тот замечательный факт, что химический сдвиг - в той или иной степени величина всегда анизотропная. То есть, химический сдвиг зависит от ориентации электронной оболочки магнитного ядра по отношению к внешнему магнитному полю #о. Количественно эта анизотропия характеризуется тензором 3x3, который, как и изотропный химедвиг, также зависит от электронной структуры молекулы. Таким образом, при реориентации тензора анизотропии химического сдвига (АХС), вызванного молекулярным движением, происходит изменение химедвига магнитного ядра, которое можно зарегистрировать с помощью соответствующих ЯМР-экспериментов.
15
Наконец, третья группа ЯМР-экспериментов следит за диполь-дипольным взаимодействием магнитных ядер друг с другом. К этой группе относятся, прежде всего, ЯМР-рслаксационные методы. Диполь-дипольное взаимодействие зависит от расстояния между магнитными ядрами и ориентации межъядерного вектора по отношению к внешнему магнитному полю. И то, и другое может модулироваться внутренней молекулярной динамикой. Флуктуации этого взаимодействия вызывают переходы между зеемановскими уровнями, что определяет скорость СПИН-решеточной магнитной релаксации. По времени релаксации можно в принципе судить как об амплитуде, так и о частоте молекулярного движения. В твердом теле межъядсрное диполь-дипольное взаимодействие и степень его усреднения молекулярным движением также определяют и ширину линии в ЯМР-спектре (спин-спиновую релаксацию), что тоже дает информацию об амплитуде и частоте движений.
Конечно, такое деление всех ЯМР-экспериментов на три группы довольно условно, потому что многие типы экспериментов могут регистрировать движение как одного, так и другого зонда. Например, обменная спектроскопия чувствительна одновременно к изменениям изотропного химедвига и к реориентации тензора АХС, а скорость спин-решеточной релаксации может определяться одновременно диполь-дипольным взаимодействием и вращением тензора АХС и т.д. Но чаще всего получается так, что ЯМР-эксперимент дает информацию в основном об изменениях только одного зонда - изотропного химедвига, тензора АХС или межъядерного вектора. В Таб. 1.1 перечислены природные ЯМР-зонды, отражающие молекулярную динамику, и основные типы экспериментов, которые их используют для изучения динамики белков.
Следует оговориться, что поскольку в данной работе будут представлены ЯМР-эксперименты только на ядрах ,5И, ,3С и'Нв органических биополимерах, мы здесь не касаемся механизмов магнитной релаксации, которые не будут играть роли для нашего анализа, например, квадрупольной релаксации или релаксации через парамагнитные примеси. Кроме того, мы оставляем в стороне такой метод исследования трансляционной молекулярной подвижности, как ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля, поскольку он не способен регистрировать смещения магнитных ядер на доли и единицы ангстрем - это типичные амплитуды
16
Таблица 1.1.
ЯМР-зонды Эксперименты
Изотропный химический сдвиг Анализ формы линии Спин-спиновая релаксация в растворах Обменная спектроскопия
Тензор АХС Анализ формы линии в твердом теле Обменная спектроскопия Спин-решеточная релаксация на высоких резонансных частотах
Диполь-дипольное межъядерное взаимодействие Спин-спиновая и спин-решеточная релаксации
внутримолекулярных движений в белках. Что же касается остальных ЯМР-методов по исследованию молекулярной динамики, то ниже мы их рассмотрим подробнее.
1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига.
В самом простейшем случае, когда мы имеем в образце только один химический тип магнитных ядер, имеющих одинаковую ориентацию, спад свободной индукции (поперечной намагниченности) выражается так:
йб(/)=л/,(0+н^(0=
Л/0 (соэ *У0/ + І БІП (0^)е1,Тг = М0еШ(/е~,,Тг
(1.1)
где Мо - равновесное значение намагниченности, Г2 - время поперечной релаксации, соо - круговая резонансная частота, определяемая внешним магнитным полем Во. ЯМР-спектр представляет собой Фурье-преобразование спада поперечной намагниченности во временной области, что в данном простейшем случае приведет к простой лоренцевой форме линии:
£(©) = \м,е0/еч1Т'Л =--------------. (1.2)
I 0 1(в-в0) + 1/Г2
17
Как упоминалось выше, химический сдвиг магнитного ядра может зависеть от ориентации молекулы по отношению к внешнему магнитному полю. Эта ориентационная зависимость определяется тензором АХС, она имеет следующий вид:
= > 0*3)
где у - гиромагнитное отношение магнитного ядра, Во - внешнее постоянное магнитное иоле, а сг2г - гг-элемент матрицы тензора АХС в предположении, что внешнее магнитное поле Во направлено вдоль оси г. В координатной системе главных осей тензора АХС, то есть в системе, где недиагональные элементы равны нулю, этот тензор имеет вид
4i 0 0 '
<T™ = 0 ^22 0
0 \ 0 ^33 >
где элементы <7ц, <722 и <733 определяют химический сдвиг магнитного ядра, если направление Во совпадает соответственно с осями х, у и z этой системы координат (индекс "PAS'1 является сокращением от principal axes system). Для перехода из системы главных осей тензора АХС в лабораторную систему используется стандартное преобразование:
<г^ = Л(а, (1.5)
где і?(а,Р,у) - матрица перехода из одной системы координат в другую (LF -laboratory frame), а, р и у - углы Эйлера, описывающие последовательные повороты системы координат при переходе в новую систему: а соответствует первому повороту вокруг оси z, р описывает поворот вокруг новой оси х, и, наконец, у - это поворот вокруг новой оси z. В явном виде эта матрица преобразования выглядит так:
/
Д(а,Р.У) =
cosacospcosy-sinasiny sinacospcosy+cosasiny -sinpcosy> - cos a cos p sin y-sinacosy - sin a cos p sin y+cosacosy sin psiny
cos a sin p sin a sin p cosp
. (1.6)
18
Вышеприведенные формулы позволяют определить резонансную частоту магнитного ядра при любой ориентации тензора АХС по отношению к внешнему магнитному полю. Если образец изотропен, то есть он представляет собой аморфное тело, поликристалл или порошок, то в нем существует равномерное распределение тензоров АХС по всем возможным ориентациям, а значит и распределение химических сдвигов. Для того, чтобы определить форму линии ЯМР-спектра для этого случая, необходимо проинтегрировать ур-е (1.2) по всем ориентациям тензора АХС. В результате этой, описанной во многих учебниках по ЯМР, стандартной процедуры получается хорошо известная форма линии спектра статического порошкообразного образца. Примеры таких спектров при различных соотношениях ап, 022 и 0зз показаны на Рис. 1.1 (рисунок из монографии [17], в этих расчетах принимается, что \/Т2«(Озу(Г\\У/Во).
Форма спектров, представленная на Рис. 1.1, характерна для ядер, имеющих спин /г. Для ядер же, которые имеют спин 1 (из них для исследования биомакромолекул наиболее важны дейтероны), форма спектра всегда зеркально симметрична относительно изотропного химедвига (см. пример ниже). Это связано с тем, что из-за квадрупольного расщепления поперечная намагниченность этих ядер состоит из двух компонент, каждая из которых имеет свою частоту прецессии. И тогда в выражении (1.1) el<v следует заменить на (e,<v +e",<v)/2. Все остальные детали расчетов остаются без изменений.
У
Рисунок 1.1. Формы спектров твердотельного ЯМР изотропного образца. Частоты сох, ©у и со2 соответствуют химедвигам <тц, о?ь и 033. Ноль на оси х соответствует изотропному (усредненному) химическому сдвигу. Левый рисунок - частный случай аксиально симметричного тензора АХС, когда 0||=022*
19
Спектры, показанные на Рис. 1.1, могут дать информацию о параметрах тензора АХС. Но еще большую информативность эти спектры приобретают при наличии в образце молекулярного движения, которое стохастически модулирует ориентацию тензора АХС. В этом случае форма линии претерпевает изменения, и по этим изменениям можно судить о параметрах молекулярной динамики. В предельном случае быстрого (так, что частота молекулярного движения много больше, чем со2-сох) изотропного движения весь спектр "схлопывается" в одну линию на резонансной частоте, соответствующей изотропному химсдвигу:
Именно такие линии мы всегда наблюдаем в растворах. Наиболее сложный, хотя и наиболее интересный, случай имеет место в твердых телах, когда частота молекулярного движения совпадает по порядку величины с АХС, то есть с разницей со2-сох. Для того, чтобы рассчитать форму линии для этого случая используется стандартный подход, описанный, например, в монографии [17]. Он состоит в следующем.
Допустим, что молекулярное движение состоит из перескоков тензора АХС между N возможными ориентациями. (В случае непрерывного распределения ориентаций N будет стремиться к бесконечности, однако на практике всегда молекулярное движение можно аппроксимировать перескоками между конечным числом дискретных состояний.) Тогда хорошо известные уравнения Блоха несколько модифицируются: движение каждого изохромата намагниченности,
соответствующего одной из N ориентаций, определяется двумя процессами. Во-первых, прецессией вокруг внешнего магнитного поля
^0 “ ^ ^о(°П + С22 + °3з) *
(1.7)
(1.8)
и, во-вторых, обменом между различными изохроматами
НА/ N
(1.9)
20
где у - номер одной из N ориентаций, Кд - при вероятность перескока в единицу времени из ориентации к в ориентацию у, и Кд определяет вероятность перехода из состояния у во вес остальные ориентации, которая имеет отрицательный знак, ц есть резонансная частота ориентации у, которая определяется соответствующими эйлеровыми углами. Объединяя ур-я (1.8) и (1.9), можно записать общее уравнение Блоха в векторно-матричном виде:
Ш
б/
=(/ви-к ж,
(1.10)
где М - И-размерный вектор, со - диагональная матрица с элементами со^д^ц, К -описанная выше обменная матрица. Интегральная намагниченность образца есть сумма всех изохроматов, которая может быть выражена как
м(о=£л/,(о=1 -м, >1
(1.11)
где 1=(1,1,...,1). Отсюда можно получить формальное решение этого дифференциального уравнения:
М(/) = 1-[е“,Л)'л7(0)]. (1.12)
Что касается экспоненциальной матрицы в ур-и (1.12), то в явном виде ее можно представить как
ехрЦО 0 ... 0
0 схр(яу) ... 0
ехр(А0 = 1*о
(1.13)
0 0 ... ехр(аЛ,/)
где а\9 а2,.:,ац - собственные значения матрицы А, -матрица преобразования, приводящая А к диагональному виду.
Представленные выше формулы позволяют описать форму линии ЯМР-спсктра в произвольном случае, если известны (или заданы) параметры тензора АХС, его возможные ориентации и обменная матрица К. Смысл изучения молекулярной
21
динамики с помощью анализа формы линии твердотельного ЯМР-спектра состоит в том, чтобы подобрать такую модель молекулярного движения (то есть ориентации тензора АХС) и такую его частоту (то есть обменную матрицу К), чтобы расчетная и экспериментальная формы линии спектра совпадали. Необходимо заметить, что этот метод анализа может хорошо работать только в том случае, если ширина линии, обусловленная временем поперечной релаксации Т2 и распределением изотропных химсдвигов пренебрежима по сравнению с величиной АХС. Анализ формы линии может быть информативен только при изучении движений, частота которых сравнима с величиной АХС. В большинстве случаев этот частотный диапазон соответствует единицам-сотням килогерц. Пример изменения формы линии в зависимости от частоты молекулярного движения (иначе говоря, температуры) представлен на Рис. 1.2 (рисунок из монографии [17]).
1.3. Вращение образца под магическим углом.
Только что было показано, что АХС является замечательным свойством ЯМР, позволяющим определять параметры молекулярной динамики. В то же время, уширение линии, вызванное эффектом АХС, зачастую не дает возможности отличить в спектре друг от друга химически неэквивалентные ядра, то есть ядра, имеющие различный изотропный химический сдвиг. Что же делать? Почти полвека назад Рэймонд Эндрю предложил оригинальный способ сужения линий в твердотельных спектрах ЯМР, который с успехом используется и по сей день - механическое вращение образца вокруг оси, направленной под магическим углом
Рисунок 1.2. Форма линии спектра дейтеронов метальной группы при допущении вращательных скачков между тремя равновероятными положениями вокруг оси симетрии метальной группы. Скорость скачков выражена в единицах величины АХС.
22
- Київ+380960830922