*0ЄСИИС*.А*‘
■АЪШ
Содержание
Введение : II §1. Описание прибора^ИЯ^^И^Я
1.1 Ионный источник и система транспорта ионовЦ Щ! 1 -2 Время-пролетный масс-анализато𠧧1.3 Молекулярно-Ионный Реактор (МИР)||
М'/г'У/у/.- s.s/s
ЩЩЛЛ Большой ионно-транспортный радиочастотный (RF-only) квадруполь1Щ
iil.5 Одиночная линза ШШНШШШОШИШПШ Ifff 1.6 Ортогональный время-пролстный накопитель-модулятор ионного пучкаЦ
ЦП.7 Рефлектор масс-спектрометра|ШШШ11Я^11Ш1 НИ 1.8 Детектор ионов!
Il.9 РезюмеТ“
ivixi t к'У<уК^ Й/Уу//>/%
щіі
Ё201
12. Параметры Орто-ВПМС высокого разрешения.!-,
Щ2.1 Введеш.е1»1МИ111»1»11а11
2.2 Разрешающая способность -ЖДЯНЩИМ Щ 2.3 Примеры масс-спектров различных веществ'^111
ШЩЩЩ- Р
'УУУлМр//УУ'-'У* Л'У/'МУУ/. -к'У/Х
......................................................
zy,y,syy.'sf'. у '//,У/у////у У,У/,ЇУ/.УУуМУУ-'У'/УУУ'‘ '/''■ '■ 'У/У/' ■>sss./ysssyysy/ss/y/y/////sy/yy////.'/-'sss/./.ss.y/fsss‘s
УУ/Уг
«-'/'< ''/'/''/'// 'Уу/У/У/ У'Й/У//''/ уУУ'У-у/'', 'уУууууу/
'< <'< * 'Щ'/уЛ-У,','/', Ыщ 'у/У/у' Г'у'Уу'/. '// У'/ 'У'У/У у "У/ '/У-у.ууу/у/ууу/ -- < * -»х-х
Ш21І
ЙШ2.4 Точность определения массьЦ^||!
1|1|2.5 Анализ причин, ограничивающих разрешение Орто-ВПМС|1|Ш^1111йШ-1|щ2.6 Моделирование формы пика в масс-спектре численным методом!-***™ ■2.7 Выводы!!»*»
- - - - • ; <..................................................
р. Молекулярно-Ионный Реактор (МИР)!||||||1
3 1 Ийрирнир и пбчпп ГШТРПЯТУПМ;: ''
Л.1 сведение И иизор ЛИ1Ср<11урЫ
|||:3.2 Подходы к описанию свойств (ЯК-оЫу) квадруиолей с газом (теория)НЩ! 3.3 Экспериментальные данные по фокусировке ионов в МИР
< ; . .. ........ .......... • • -У..,У у//'/,■//,/,/-у/, •;-< > . •■. . ....
у,*у/уу*у* ч Л К1.ША тх'у'уу- <Ууу/У%уууУУъ4УУУ^ Уу'уУ'с^У^УУУу'у'ууУУуУУуУуУУУУуууУУуужУ^УЯуу^^ Уу' у У''уу/ 'У; 'У/УуА^//у-6УУ,1 '. Ка///,
|4. Метод измерения подвижностей ионов в МИР ||||||||!
ІІ36І
Ш
'/'s'//.',
4.1 Введение и обзор литературы
.: : : : ; ::
йШню ®w
Й4І
2 т ьїЩЩ: ■
І ЛАПНа ... .,■.■..'■/'./■.... ■■■■.■ A.A.-. v.-v. '*
г-..;;
4.3 Ограничения метода!ßif§§||§§!|
4.4 Экспериментальные результаты; і
'/у. У. 'ууууУл ууУуу уУуууууЛ
" • УУ/,У,уїуу/уУУ,У,у. sys, . 'У''/'уУ'.'///.'/ 's/Л '/,
•SSSSS-Ss'sSyS. S SS S, A av> ✓.;.
. ^/УУУууУ' У’ 'УУ/ ‘УУУУ, '
■тшщтющж
....-s’- **// V/// •'
Уу/уУУуУУУ,
'У,/.'//ґУ,У, 's'/, s 's-. ,y/'s'/. /Уу/ssysy, A ’//s's-'s SS's sys s. 's.'/'' •'/'■ >•'
vs?/#y. ''У“' '<ууууу-'''У '"'/УУ'/у''У'''/У''''
46
;5. Исследование фрагментации и превращений ионов, движущихся в ||||Я МИР под действием электрического поля при давлениях ~1торр
5.1 Введение и обзор литературы .: :^М1§§|§1?;^
Ш 52
•ууіф/л^мі
'. SS. s.'s А , .
-AV> V < 'S.'s/
52
І5з:!
Ilf 5.3 Определение энергии активации реакции распада ионов азида в МИРЩр||55|
1
УуУуу./у-. >< ';у^*у*/-/>/Ууу.'
Ш-
•У/УЖА<№у/+ 'Л
шщ
квадруполе с газом
описание
жШш*
ПОЛЯ
ШЩЩ!:
'УУУУУУУУ'У
-у'Ш-
■У/УУУ 4'/УУ: /У У:УУУУУ:..'Л
Литература
6. Получение информации о структуре пептидных ионов с помощьюЩ^ 60 фрагментации постоянным или переменным полями в МИР при давлениях ~\™юШШШШШШШШШШНШЯШВГ ■6.1 Введение!!
ЯЯб.2 Фрагментация ионов пептидов в МИР, активированная продольным61
электрическим
полем. Получение информации о структуре.||Шв5#Шш
<£%«• > уу/&УУ&аУу/уууУ уу/.<
?Ц 6.3 Новый метод селективной фрагментации ионов в МИР ГТ§гШ*Г£,1 64
' 6.4 Эксперименты по анализу структуры ионов при фрагментации их ||
|| :П 1.1 Время разворота |§||
;1Й11.2 Пространственная фокусировка ионо⧧р
! А. Линейный ВПМС с фокусировкой первого порядка, 78
Ь. Линейный ВПМС с фокусировкой 2-го порядка
111.3 Сравнение разрешающих способностей и аксентансов ВПлМС 871
Приложение 2. Движение иона в ИР-оЫу |§§|П2Л Приближенное Й1ЩП2.2 Распределение ионов в
Приложение 3. Описание разогрева иона, движущегося в газе действием постоянного электрического
2
Введение
Масс спектрометрия является одним из наиболее чувствительных и точных методов анализа газов, жидкостей, а также органических твердых веществ. Долгое время применение масс спектрометрии в биологии и медицине ограничивалось анализом небольших летучих органических молекул. Дело в том, что для масс-спектрометрического анализа необходимо создать газофазные ионы исследуемою образца и при определенных условиях (энергия ионов, время жизни) транспортировать их в масс-анализатор, работающий, как правило, в условиях высокого (-Ю' торр) вакуума. Применение традиционного метода ионизации электронным ударом требует испарения образца в газовую фазу, что оказывается эффективным лишь для сравнительно небольших летучих органических молекул. Методы десорбции и ионизации нанесенной на матрицу пробы лазерным импульсом (Matrix assisted laser desorption/ionization (MALDI)) 11] и Экстракции Растворенных Ионов при Атмосферном Давлении (ЭРИАД [2] или Electrospray [3-
5](ES1)) оказались чрезвычайно эффективными для анализа разнообразных биологических, а впоследствии и просто органических и неорганических молекул. Изобретение этих методов явилось своего рода вторым рождением масс-спектрометрии для биохимии, медицины, и координационной химии.
Метод экстракции растворенных ионов при атмосферном давлении был в одно и то же время независимо открыт советскими и американскими исследователями, однако ввиду преимущественного распространения в мире англоязычной научной литературы общепринятым стало название Electrospray (ESI), объединяющее множество различных модификаций данного метода.
Поскольку ионный источник типа ESI принципиально дает квазинепрерывный ионный пучок, первоначально он использовался на магнитных и квадрупольных масс-спектрометрах. Соединение ESI с время-пролетным масс спектрометром считалось бесперспективным, т.к. традиционно это требовало стробирования ионного пучка, ограничивая эффективность использования ионного тока на уровне
0.1-Я).0025% [6] (при разумном разрешении). Однако при более серьезном и внимательном подходе эта проблема была изящно решена изобретением и созданием нового типа время пролетных масс спектрометров с ортогональным вводом ионов (Орто-ВПМС) [7]. Первый ВИМС типа рсфлектрон с ортогонатьньгм вводом ионов от источника типа ESI (ESI Op ro-ВПМС) был создан в нашей лаборатории в 1987 г. Прибор имел разрешение ~ 1500-2000 на полувысотс пика при эффективной длине дрейфа - 2.15 м. Был проведен подробный анализ причин, влияющих на разрешение прибора такого типа и сделаны теоретические оценки максимально достижимой разрешающей способности [7-12].
Применение времяпролетного масс-анализатора имеет ряд преимуществ -нео!раниченный диапазон масс, возможность регистрации ионов всех масс с минимальными потерями и быстрота развертки масс спектров. Кроме того, в условиях регистрации полною масс-спектра за 200-300 микросекунд достигается чувствительность, б.(тзкая к режиму селективного ионного детектирования в
3
квадрупояьных или магнитных масс спектрометрах. Поэтому Орто-ВПМС с ионным источником ESI очень быстро развиваются и на данный момент становятся незаменимыми инструментами для исследований в современной биохимии, имеющих дело с большими молекулами пептидов, белков и полинуклеотидов Г13-16].
Одним из направлений развития ESI Орто-ВПМС является повышение разрешающей способности и точности определения величины m/z (отношения массы ш [а.е.м.] к зарядовому числу z) ионов, регистрируемых в масс-спектре. В этом направлении работают академические исследовательские группы и лаборатории ведущих фирм - производителей ESI Орто-ВПМС. Одним из основных направлений развития ESI Орто-ВПМС является повышение разрешающей способности и точности определения масс. На данный момент рабочая разрешающая способность большинства коммерческих приборов составляет -5000 на полувысоте пика, а точность определения массы ионов -10 1 -10 °. Точность определения массы иона оказывается гораздо выше, если измерить m/z моноизотопного пика. Молекулярная масса М ионов, изотопные пики которых могут быть разрешены в масс-спектре, ограничивается разрешающей способностью R (па полувысоте): Повышение разрешающей способности
до 15000-20000 позволило бы определять моноизотопную массу ионов до 10000-13000а.е.м.. Кроме этого, по расстоянию между разрешенными инками изотопного распределения легко и точно определяется зарядность иона. Этот способ определения зарядности необходим при наличии в образце смеси различных соединений. Высокое разрешение ESI Орто-ВПМС на уровне -20000 дает также возможность разделить в масс-спектре пики ионов изобарического состава, отличающиеся по весу на несколько десятков миллимасс. Точность определения массы на уровне 10'5-И0'6 позволяет эффективно подбирать и подтверждать элементный состав иона. Все эти задачи актуальны в свете современных применений ESI Орто-ВПМС в биохимии, фармакологии и химии метаплокомплексов. Ряд опытных образцов таких приборов в настоящее время уже имеет разрешение >10000 на полувысоте пика, точность определения m/z —10° [17-22], причем отмечается чувствительность в фемтомольном диапазоне [5,8,22-24]. Характерно, что ведущими разработчиками и создателями ESI Орто-BIIMC ведущих фирм являются экс-согрудники нашей лаборатории и их коллеги из российских НИИ.
Поскольку при экстракции растворенных ионов в ионном источнике типа ESI образую гея молеку лярные и квазимолекулярные ионы, для исследования структуры и превращений таких ионов интенсивно используются методы тандемной масс-спектромстрии (МС/МС), существует огромное количество работ, посвященных масс-спектрометрическому секвенсу протеинов, постоянно создаются новые чувствительные и эффективные методики [25-32]. Львиная доля работ по секвенсу и исследованию превращений ESI-ионов в камере столкновений МС/МС прибора была сделана на “тройных” квадрупольных масс-спектрометрах модели API III SCIEX.
4
Совсем недавно были созданы тандемы, где в качестве второго масс-анализатора применен Орто-ВПМС высокого разрешения [20,22,32]. Таким образом появилась возможность анализировать продукты превращений выделенных Е81-ионов при одиночных столкновениях с молекулами буферного газа в камере столкновений, с высоким разрешением и точностью определения m/z.
Созданный при участии автора и описанный в диссертации прибор представляет собой Е81 Орто-ВПМС высокого разрешения с уникальным Молекулярно-Ионным Реактором (МИР). МИР позволяет исследовать структуру и превращения экстрагируемых из раствора в источнике типа Е81 ионов, и является одновременно интерфейсом такого ионного источника к время пролетному масс-спектрометру с ортогональным вводом ионов. Он представляет собой секционированный радиочастотный квадруполь, с постоянным элекзрическим полем вдоль оси, работающий при давлении ~1торр. 11еремсннос радиочастотное напряжение подается на квадруполь в симметричной квадрупольной моде, и для таких квадруполей в международной научной литературе принят термин ЯГ-оп1у. Этот термин далее используется в тексте диссертации.
11ри работе с МИР было обнаружено новое явление фрагментации исследуемых ионов переменным радиочастотным (ЯР) полем . Вместе с фрагментацией продольным электрическим полем это явление можно эффективно использовать для определения структуры (секвенса) пептидов. Высокая разрешающая способность и точность определения массы с помощью Орто-ВПМС делает эту методику весьма надежной.
Интерес к изучению свойств больших квазимолекулярных Е81 ионов и их продуктов постоянно растет, и исследования кинетики превращений таких ионов проводились также различными другими методами [33,34,68-70]. Удобной является их уникальная стабильность в газовой фазе - они обладают практически неограниченным временем жизни в газовой фазе, в вакууме и при атмосферном давлении. Как показано в диссертации, одним из ключевых параметров, определяющих разогрев иона при движении в газе под действием электрического поля является его подвижность. Увеличивающийся интерес к измерению подвижностей [57-61] связан также с применением дрейф-спектрометра в качестве ионного хроматографа, для предварительного разделения ионов больших нековалентно-связанных белковых комплексов, пики которых часто перекрываются в масс-спектрах. Предложенный в диссертации метод определения подвижности ионов позволяет измерять коэффициенты подвижности непосредственно в условиях эксперимента по анализу кинетики фрагментации ионов.
Цель работы:
Разработка методов исследования экстрагированных из раствора в газовую фазу ионов с помощью время-пролетного масс-спектрометра высокого разрешения, снабженного молекулярно-ионным реактором (МИР). Теоретический анализ и численное моделирование для изучения возможностей повышения разрешающей способности Орто-ВПМС. Теоретическое и экспериментальное исследование процессов фокусировки ионов переменным электрическим полем в КТ-оп1у
5
квадрупояе с газом при давлении ~1торр. Исследование разогрева ионов и реакции их распада (фрагментации) при движении в газе под действием постоянного (продольного) и переменного электрического поля в НГ-оп/у квадрупояе. Исследование возможности получения структурной информации (секвенса) с помощью фрагментации £6У ионов пептидов.
Диссертационная работа состоит из введения, шести глав и трех приложении.
Первая глава посвящена описанию конструкции созданного Орто-ВПМС высокого разрешения с ЕБГ источником ионов и Молекулярно-Ионным Реактором (МИР). Подробно изложены технические решения, благодаря которым удалось достичь рекордных разрешающей способности и точности определения массы.
Во второй главе приводятся основные экспериментальные результаты, демонстрирующие разрешающую способность и точность определения массы с помощью созданного прибора, а также полученные из теоретического анализа соотношения между достижимой разрешающей способностью прибора, фазовым объемом входящего ионного пучка и техническими параметрами прибора. Также приведены данные моделирования формы пика в масс-спектре и пространственного разброса ионов с помощью написанной автором программы для ПК.
Третья глава посвящена теоретическому' и экспериментальному анализу свойств оригинального Молекулярно-Ионного Реактора (МИР), представляющею ЛТ-оп1у секционированный квадруполь, работающий при давлении буферного газа ~1торр.
В четвертой главе описана оригинальная методика определения подвижности выбранных ионов, движущихся в Ю;-оп1у квадрупояе с газом, по измерению порога нестабильности Матье.
В пятой главе приведена теоретическая модель для определения внутренней температуры иона, движущегося под действием постоянного электрического ноля в газе и на основании этой модели сделан анализ экспериментальных данных и определено значение величины энергии активации реакции распада ионов в МИР.
В шестой главе приведен ряд примеров определения структуры (секвенса) коротких пептидов с помощью анализа спектра фрагментов исходных ионов пептидов в МИР. Описан предложенный оригинальный метод фрагментации выбрашшх ионов при контролируемом увеличении амплитуды ЯР-поля в МИР.
В приложениях 1,2 и 3 приведены теоретические выкладки для анализа разрешающей способности ВПМС различных конфигураций, движения ионов в ЯР-квадруполях с газом и для определения внутренней температуры иона, движущегося в буферном газе под дейст вием электрического поля.
6
- Київ+380960830922