Кристаллографическое исследование структурной изменчивости фрагментов ДНК

Содержание
Введение........................................................... 7
ГЛАВА 1. Дискуссия: тонкая структура и структурная изменчивость двойной спирали (по литературе). Задачи диссертационной работы............... 13
1.1 Дифракция на волокнах и разные формы двойной спирали.........13
1.2 Появление кристаллографии олигонуклеотидов.................. 16
1.2.1 Структура гексамсра СвСвСС. Открытие Ъ-ДНК............ 17
1.2.2 Чередующаяся пурин-пиримидиновая последовательность . 20
1.2.3 Кристаллическая упаковка 7-ДНК.........................22
1.2.4 Додекамер СвССАА ГТСвСС и октамер СОТАТАСС первые
представители фрагментов В- и А-ДНК.....................23
1.3 Тонкая структура двойных спиралей............................26
1.3.1 Возможно ли «непрямое» узнавание белками участка ДНК? Структура комплекса /ф-репрессор/оператор....................27
1.3.2 Правила Калладайна.....................................29
1.3.3 Определения, используемые при описании структуры ДНК .32
1.4 Форма двойной спирали в кристаллах олигонуклеотидов..........38
1.5 Влияние окружения на структуру фрагмента ДНК.................43
1.6 Структурная изменчивость фрагментов ДНК. Задачи диссертационной работы ......................................................48
ГЛАВА 2. Методические особенности кристаллографии ДНК (по литературе) .................................................................... 50
2.1 Об отличиях в кристаллизации олигонуклеотидов и белков .....51.
2.2 Методы определения структуры олигонуклеотидных дуплексов ..52
2.2.1 Тяжелоатомные производные..............................52
2.2.2 Прямой поиск.......................................... 54
2.2.3 Максимум энтропии......................................56
2.2.4 Молекулярное замещение. Программа АМоЯе................57
3
2.3 Кристаллографическое уточнение. Программа X-PLOR..........62
2.4 Анализ структуры фрагментов двойных спиралей. Программы NEWHELIX и CURVES........................................70
ГЛАВА 3. В-ДНК: структура додекамера CGCTCTAGAGCG и октамера CGCTAGCG. Тонкая структура последовательности CTAG в различном окружении...................................................... 74
3.1 Методическая часть....................................... 75
3.1.1 кристаллы........................................... 75
3.1.2 сбор данных......................................... 76
3.1.3 определение и уточнение структуры додекамера CGCTCTAGAGCG ............................................ 76
3.1.4 определение и уточнение структуры октамера CGCTAGCG 78
3.2 Особенности кристаллической упаковки до декамеров В-ДНК с CG-концами .................................................79
3.3 Упаковка додекамеров в столбики и средний угол спирального поворота ..............................................................83
3.4 Схемы упаковок дуплексов другой длины с CG-концами .......85
3.4.1 Декамеры.............................................85
3.4.2 Октамеры.............................................88
3.5 Упаковка додекамера CGCTCTAGAGCG и октамера CGCTAGCG в реальных кристаллах .....................................89
3.6 Сравнение структуры двух дуплексов додекамера CGCTCTAGAGCG и трех дуплексов октамера CGCTAGCG..............................93
3.6.1 структурные параметры................................93
3.6.2 особенности анализа локальных и средних структурных параметров ДНК-фрагментов.................................96
3.7 Тонкая структура тетрамера CTAG в различном окружении 97
3.8 Основные результаты и выводы.............................103
ГЛАВА 4. Метод фазовых диаграмм для кристаллизации олигонуклеотидных дуплексов. Получение различных кристаллических модификаций дуплекса 106
4.1 Фазовые диаграммы для двухкомпонентной системы дуплекс/спермин 106
4.2 Модель, описывающая двухкомпонентную систему................108
4.3 Влияние MgCl2, и МПД на вид диаграмм........................111
4.4 Постановка кристаллизационных проб......................... 115
4.5 Получение разных кристаллических модификаций самокомплементарных GC-содержащих фрагментов .......................................122
4.5.1 гексамер pCGCGCG ..................................... 122
4.5.2 тетрамеры GGCC и pGGCC.................................124
4.5.3 октамер CCCGCGGG ..................................... 130
4.6. Примеры других кристаллизационных систем с олигонуклеотидами .......................................................... 132
4.7. Основные результаты и выводы............................. 138
ГЛАВА 5. Структура Z-ДНК в трех кристаллических модификациях гексамера pCGCGCG. Рекомбинационно-подобная структура (RLS) гексамера CCGCGG .....................................................................141
5.1 Методическая часть..........................................142
5.1.1 кристаллы..............................................142
5.1.2 сбор данных............................................142
5.1.3 определение и уточнение структуры гексамера pCGCGCG в трех кристаллических модификациях................................ 143
5.1.4 определение и уточнение структуры гексамера CCGCGG ... 148
5.2 Кристаллическая упаковка гексамера pCGCGCG................. 150
5.3 Новые взаимодействия между дуплексами Z-ДНК................ 152
5.4 Ориентация двух молекул Z-ДНК «лицом-к-лицу»................154
5.5 Особенности стэкинг-взаимодействий между дуплексами в столбике . 155
5
5.6 Сравнение структуры гексамера Z-ДІІК в различных кристаллах. Тонкая структура спирали и средние спиральные параметры........... 158
5.7 Необычная структура гексануклеотида CCGCGG. Спаренные дуплексы.................................................161
5.8 Структура центрального тстрамера в гексамере CCGCGG........164
5.9 Межмолекулярная пара оснований (ibp).......................167
5.10 Ионно-водные мостики между спаренными дуплексами......... 168
5.11 Z-ДНК и рекомбинация......................................169
5.12 Основные результаты и выводы..............................174
ГЛАВА 6. А-ДНК: структура октамера pCCCGCGGG в пяти кристаллах разной компактности и необычные свойства додекамера CGCCCGCGGGCG ... 176
6.1 Методическая часть........................................ 176
6.1.1 кристаллы............................................176
6.1.2 сбор данных..........................................178
6.1.3 определение и уточнение структуры октамера pCCCGCGGG в разных кристаллах..........................................178
6.1.4 определение и уточнение структуры додекамера CGCCCGCGGGCG 181
6.2 Кристаллическая упаковка и контакты между молекулами 183
6.3 Октамер pCCCGCGGG..........................................188
6.3.1 анализ локальных структурных параметров..............188
6.3.2 поведение усредненных структурных характеристик при возрастании компактности.................................. 195
6.3.3 замыкание главного желобка...........................197
6.4 Додекамер CGCCCGCGGGCG.....................................198
6.4.1 изгиб дуплекса - второй способ замыкания главного желобка ... 193
6.4.2 структура центрального октамера......................200
6.4.3 особенности поведения CG-концов; промежуточная А/В-конформациия...............................................205
6
6.4.4 кинк в структуре А-ДНК ...........................207
6.5 Структурная изменчивость А-ДНК.........................210
6.6 Основные результаты и выводы...........................211
ЗАКЛЮЧЕННОЕ .................................................214
ВЫВОД1Л......................................................216
БИБЛИОГРАФИЯ.................................................218
7
Введение
Долгое время метод рентгеновской дифракции на волокнах был основным методом изучения структуры ДНК. Именно с помощью дифракции на волокнах была открыта двойная спираль, описаны две ее основные структурные формы, В и А, определены средние спиральные параметры этих форм и изучены некоторые особенности их поведения в различном окружении. Тем не менее, структурная информация, которую позволяет получить рентгеновская дифракции на волокнах, ограничена и для изучения детальной структуры молекулы этот метод не пригоден. Поэтому, как только становится возможным синтез разнообразных фрагментов ДНК в количествах,
достаточных для получения кристаллов и проведения рентгеновского эксперимента, на смену дифракции на волокнах приходит
рентгеноструктурный анализ монокристаллов. Появляется и начинает быстро развиваться новая область кристаллографии биомакромолекул
кристаллография ДНК. С ее возникновением структуру двойной спирали начинают изучать подробно, выявляя тонкие детали, важные для понимания механизмов, связанных с функционированием ДНК.
Первые же работы по кристаллографии ДНК показывают, что двойная спираль обладает тонкой структурой, т.е. локальные параметры спирали у разных участков различаются (Dickerson & Drew, 1981; Shakked et al., 1983; Wang et al., 1982). Отмечается корреляция между значением этих параметров и нуклеотидной последовательностью участка (Calladine, 1982; Dickerson, 1983). Обнаруживается новая структурная форма двойной спирали, Z-ДНК (Wang et al., 1979; Drew et al., 1980; Wang et al., 1984, 1985) и структурные конструкции, формируемые ионно-гидратным окружением различных форм двойной спирали (Conner et al., 1982; Drew & Dickerson, 1981; Kopka et al., 1983). При этом в самом начале кристаллография ДНК ставит своей целью описание структуры известных форм двойной спирали (А, В и Z) с максимально высоким
8
разрешением. Однако очень скоро фокус смещается к изучению влияния нуклеотидной последовательности на тонкую структуру двойной спирали и в последующие 10-15 лет исследование этого эффекта остается одной из основных задач кристаллографии ДНК. В значительной степени этому способствуют результаты рентгеноструктурного исследования комплекса trp-репрессора с оператором (Otwinowski et al., 1988), на основании которых авторы заключили, что данный репрессор узнает свой операторный участок не путем образования специфической системы водородных связей белка с группами оснований, формирующими определенный донорно-акцепторный узор в желобках двойной спирали, а за счет того, что данная нуклеотидная последовательность навязывает фрагменту ДНК определенную тонкую структуру, которую и узнает белок. Хотя правильность данного вывода до сих пор остается под сомнением, он стимулировал работы по изучению влияния нуклеотидной последовательности на тонкую структуру ДНК, что привело к возникновению исследовательских групп, занимающихся кристаллографией ДНК в различных странах, и к определению структуры большого количества различных олигонуклеотидов, т.е. в конечном итоге, к развитию области. По мере ее развития на передний план начинают выходить другие задачи. Однако, ответ на вопрос о взаимоотношении нуклеотидной последовательности и тонкой структуры двойной спирали, как и само понятие «тонкая структура» для двойной спирали, остаются неясными. Действительно, какую из тонких структур считать структурой данного фрагмента, если для молекулы ДНК и любого се фрагмента характерна структурная изменчивость и тонкая структура меняется в зависимости от условий? Этот вопрос приобретает особую важность, если вспомнить, что в клетке ДНК всегда либо упакована в компактные структуры, в которых ее фрагменты находятся в контакте друг с другом и с белками, либо образует комплексы с белками и другими молекулами, важные для выполнения ее биологических функций. Таким образом, ДНК in vivo всегда находится во взаимодействии с самой собой и с
9
другими молекулами. Следовательно, возникает вопрос о том, меняется ли и в какой степени структура фрагмента Д11К при изменении окружения, а кроме того, каковы детали различного рода взаимодействий между фрагментами ДНК и между ДНК и окружением. Иными словами, каковы структурные возможности различных форм двойных спиралей, как они могут быть связаны со взаимодействиями, в которые вовлечен данный фрагмент и, наконец, какие новые структуры может образовывать ДНК. Поиску ответов на эти вопросы и посвящена данная диссертационная работа, представляющая собой кристаллографическое исследование структурной изменчивости различных фрагментов ДНК. На примерах фрагментов В, Z и А-ДНК показано, что структура двойной спирали в кристаллах меняется с изменением окружения фрагмента, иногда значительно. Проанализированы тенденции этих изменений и их возможное значение.
Для В-ДНК на примере исследованных в работе до декамера СОСТСТАОАОСС и октамера СвСТЛОСС, а также фрагментов, представленных в банке данных по нуклеиновым кислотам, проведен анализ взаимоотношения кристаллической упаковки и структуры молекулы. Проанализированы наблюдаемые закономерности в поведении среднего угла спирального поворота. Рассмотрены вариации локального угла спирального поворота в центральной тетраде СТАв в составе октамера и додекамера. Высказана гипотеза, объясняющая наблюдаемое характерное поведение. Проведено сравнение с поведением того же тетрануклеотида в составе других ДНК-фрагментов и в комплексах с репрессорами, исследованных другими авторами. Показано, как структура одной и той же последовательности В-ДНК меняется в зависимости от окружения. Сделан вывод относительно методики изучения структурной изменчивости ДНК с помощью кристаллографии. Вывод состоит в том, что правильным подходом в данном случае было бы исследование структуры фрагмента в нескольких различных кристаллических модификациях. Для получения разных кристаллов одного и того же фрагмента
10
развит метод кристаллизации, основанный на экспериментальных фазовых диаграммах и описанный в следующей главе диссертации. С помощью данного метода получены различные кристаллические модификации нескольких олигонуклеотидов. Определение и анализ их структур и структур других ДНК-фрагментов 2 и А-формы составили экспериментальную основу следующих двух глав диссертационной работы.
Исследование фрагментов 2 и А-ДНК, представленное в работе, является частью проекта, посвященного изучению поведения чередующихся последовательностей в крист&члах. В диссертации рассмотрены фрагменты со связанной между собой нуклеотидной последовательностью. В центре во всех случаях располагается чередующейся тетрануклеотид СОСв, а самые короткие фрагменты представляют собой гексамеры. Один гексамер обладает канонической для 2-ДНК чередующейся последовательностью СОСОСО. Второй отличается от первого тем, что имеет нарушение чередования на концах, - ССССвС. Канонический гексамер изучен в грех различных кристаллических модификациях, две из которых демонстрируют новый для 2-ДНК вид кристаллической упаковки и новые взаимодействия между молекулами 2-ДНК. Второй гексамер образует дуплекс, центральная часть которого, тетрамер СОСО, имеет 2-конформацию, но концы ведут себя необычно. 5’-концевой цитозин каждой нити выворачивается из дуплекса и образует уотсон-криковскую пару с З’-концевым гуанином соседней молекулы. Таким образом, образуются спаренные дуплексы, у которых пары на концах являются межмолекулярными. Структуры гексамера СССОСО в трех новых кристаллических модификациях и в описанных ранее другими авторами кристаллах вместе со структурой центрального тетрамера СОСО во втором гексамере дают возможность продемонстрировать структурную изменчивость чередующейся последовательности СОСО в 2-конформации. Кроме того, гексамер ССОСОО является примером интересной необычной структуры, которая может иметь биологическое приложение, что более подробно
11
рассмотрено в самой работе. Здесь же хотелось бы отметить только, что эта структура отражает современные тенденции кристаллографии ДНК, которая оказывается все более и более ориентированной на изучение «необычных» структур ДНК, таких как шпильки, дуплексы из параллельных нитей, триплексы, квадруплексы и другие. Структура гексамера ССОСвв, подробно описанная в главе 5, является одним из примеров необычной структуры ДНК.
Добавление к гексамеру ССССвС по одному нуклеотиду на концах, удлинняющее нечередующиеся концевые ступени, приводит к получению кристаллов А-ДНК. Самокомплементарный октамер ССССССОС, закристаллизованный в виде пяти кристаллических модификаций разной компактности, является уникальным примером, не только демонстрирующим структурную изменчивость фрагмента А-ДНК, но также позволяющим провести систематический анализ этой изменчивости и разработать некоторые приемы подобного анализа. Дополнительную информацию об А-ДНК дает структура додекамера СОСССССССОСО, образованного добавлением чередующихся Св-ступеней на обоих концах октамера СССОСООО. В этом случае, впрочем, концевые ступени Св принимают конформацию, промежуточную между А и В, а сам фрагмент оказывается чрезвычайно сильно изогнутым в центре. На структурах октамера и додекамера обнаружены два способа практически полного замыкания главного желобка в А-ДНК. Показано также, что существуют и промежуточные структурные формы с частично закрытым желобком. Для случаев Ъ и А-ДНК выделены главные вариабельные параметры и описаны особенности внешнего вида двойной спирали при изменении этих параметров.
Результаты работы в целом позволяют получить представление о структурной изменчивости фрагментов двойной спирали разных конформаций, детали которой удастся визуализировать с помощью кристаллографии
олигонуклеотидов и анализ которой расширяет и детализирует наши представления о структурных возможностях ДНК.
13
ГЛАВА 1. Дискуссия: тонкая структура и структурная изменчивость двойной спирали. Задачи диссертационной работы.
Двадцать лет назад, в декабрьском номере журнала “Nature” за 1979 год, появилась первая статья, описывающая детальную пространственную структуру короткого фрагмента ДНК (Wang et al., 1979). Это была первая структура ДНК, исследованная с помощью рентгеноструктурного анализа монокристаллов и, к тому же, с высоким разрешением, 0.9 Â. Не только детали, но и общая структура фрагмента оказалась совершенно неожиданной. Хотя он и представлял собой двойную спираль с уотсон-криковскими парами оснований, спираль не принадлежала ни к одной из известных к тому моменту форм, В или А. В отличие от этих правозакрученных спиралей, она была левой, с зтзагообразным ходом нитей, за что и получила название Z-ДНК. Одновременно с этим открытием возникла и начала развиваться новая область структурных исследований - рентгеноструктурный анализ монокристаллов олигонуклеотидов или, коротко, кристаллография ДНК.
1.1 Дифракция на волокнах и разные формы двойной спирали
К моменту возникновения кристаллографии ДНК о структуре этой молекулы знали многое, поскольку в течение предшествующих 25 лет ее изучали методом дифракции на волокнах, с помощью которого и была открыта двойная спираль (Watson & Çrick, 1953). Пример рентгенограммы волокна ДНК приведен на рис. 1.1 (здесь и далее из книги Зенгер, русский перевод 1987). В волокне спиральные молекулы ДНК ориентированы вдоль одного и того же направления (вертикальная ось с на рис. 1.1) и азимутально неупорядочены. Поэтому дифракционная картина оказывается похожей на рентгенограмму вращения, рефлексы перекрываются, и количество получаемых данных
14
оіраничено. Параметр
элементарной ячейки с (определяется по первой слоевой линии) соответствует maiy
спирали, а номер слоевой, на которой располагается
интенсивный меридиональный рефлекс (10 на рис. 1.1), -порядку спирали. Кроме того, зная шаг спирали, по углу косого креста определяют ее диаметр. Волокна готовились как из
природной ДНК со случайной последовательностью, так и из синтетических полинуклеотидов, последовательность которых многократно повторяла блок из одного, двух или трех детерминированных нуклеотидов. Помимо этого варьировался тип противоиона и относительная влажность волокон. В результате было описано несколько форм двойной спирали (Leslie et al., 1980), показанных на рис. 1.2. Все эти формы представляли собой правые спирали, которые различались расположением уотсон-криковских пар по отношению к оси молекулы и порядком спирали, т.е. числом пар в витке, который был равен 11 для А-, 10 для В-, 9.33 для С- и 8 для D-ДНК. Описаны были также и спирали с порядком 9 и 7.5 (С’ и Е). Спирали различались по своему шагу и другим структурным характеристикам. Все они разбивались на две категории. Одна из них получила название А-ссмейства и для нее была характерна
конформация сахарного кольца СУ-эндо (рис. 1.3Б). В другой - сахар имел
конформацию С2у-эндо (рис. 1.3В) и по имени основного представителя эту категорию назвали В-семейством. Конечно, данных, полученных с волокна, недостаточно, чтобы построить карту электронной плотности и “увидеть” конформацию сахара. Однако, разная конформация сахарного кольца, задает
Меридиан
10 \
Экватор
Косой крест
Рис. 1.1. Рентгенограьша волокна В-ДНК.
15
А-0№ B•DNA США D-DNA
Рис. 1.2. Общий вид различных форм двойных спиралей ДНК по данным, полученным методом дифракции на волокнах.
разные расстояния между соседними фосфатами вдоль цепи (5.9 А для СЗ’-эндо и 7 А для С2'-эндо - рис. 1.3, справа), чего вместе с другими сведениями оказывается достаточно, чтобы построить исходную модель двойной спирали и затем уточнить ее по ограниченному числу параметров, используя при этом значения структурных амплитуд, полученных по рентгенограмме. Из таких же расчетов стало ясно, что в В- и А-ДНК пары по-разному смещены от оси спирали (рис. 1.4). Этим обусловлены различия во внешнем виде двух типов спиралей. В В-ДНК, где ось проходит через пару, желобки не очень сильно отличаются по своим геометрическим характеристикам, тогда как в А-ДИК, где ось спирали располагается в главном желобке (рис. 1.4), он становится глубоким и узким, а минорный - мелким и широким (рис. 1.2).
16
Б
А
В
С
^2' л»А>
Рис. 1.3. Нумерация атомов в сахарном кольце (а), две конформации которого СЗ ’-эндо (б) и С29-эндо (в) приводят к разным расстояниям между фосфатами вдоль цепи в А- и В-ДНК (справа).
Рис. 1.4. Расположение оси спирали относительно центра нары в разных формах двойных спиралей А, В, С и О. Показаны длинная (горизонтальная линия) и короткая (вертикальная линия) оси пары. Центр пары совпадает с точкой их пересечения.
1.2 Появление кристаллографии олигонуклеотидов
В значительной степени сведения о структуре ДНК, полученные с помощью дифракции на волокнах и конформационных расчетов, впоследствии подтвердились. Однако, необходимость детализации знаний о структуре этой важной молекулы требовала новых подходов к ее изучению. Детальную информацию о структуре двойной спирали мог бы дать рентгеиоструктурный анализ монокристаллов, но для этого кристаллизовать надо было не целую
17
молекулу ДНК, а ее не очень длинные фрагменты с детерминированной нуклеотидной последовательностью. Решающую роль в появлении таких монокристаллов сыграли успехи в области химического синтеза, благодаря которым стало возможным синтезировать олигонуклеотиды в количествах, достаточных для проведения кристаллизационных и рентгеновских экспериментов.
1.2.1 Структура гексамера CGCGCG. Открытие Z-ДНК. Первыми фрагментами, структуру которых определили, с * помощью рентгеноструктурного анализа кристаллов, стали самокомплементарные
гексамер CGCGCG (Wang et al., 1979) и гетрамер CGCG (Drew et al., 1980) с
последовательностью, в которой чередовались цитозин и гуанин. В обоих
случаях структура оказалась новой, неизвестной до того формой двойной спирали, которую мы теперь называем Z-ДНК. В кристалле гексамера CGCGCG дуплексы выстраивались стопочкой так, что получалась псевдонепрерывная спираль Z-ДНК, показанная на рис. 1.5. Таким образом, первая попытка взглянуть на детали структуры двойной спирали привела к открытию новой структурной формы, радикально отличающейся от известных к тому моменту А- и В-ДНК. Хотя, как и последние, Z-ДНК представляла собой двойную спираль
Рис. 1.5. Идеализированная Z-форма двойной спирали, построенная на основе структуры гексамера CGCGCG (Wang et al., 1979). Из обзора (Dickerson, 1992).
18
с антипараллельным ходом нитей, построенную из уотсон-криковских пар оснований, она отличалась от них знаком винта, т.е. представляла собой левую спираль. Кроме того, повторяющимся элементом спиральной симметрии являлась уже не пара оснований, а две такие последовательные пары. Иными словами, в параллель с чередованием оснований в последовательности наблюдалось чередование структур ступеней: на ступени врС происходил левый поворот (-50°) и между парами наблюдался обычный одноцепочечиый стэкинг, а на Срв-ступени поворота почти не происходило (-10°), а происходил сдвиг пары вдоль ее длинной оси, который приводил к необычному межцепочечному стэкингу между цитозинами разных нитей (рис. 1.6).
Срб
Рис. 1.6. Сокинг пар на разных типах ступеней в Z-JJJгlK. Пары, расположенные ближе, показаны более темными линиями. Проекция оси спирали на плоскость нары показана закрашенным кружком.
Совокупный угол спирального поворота двух таких последовательных пар составляет -60° и, следовательно, Z-ЦHK представляет собой левую спираль шестого порядка с двумя парами оснований в качестве спирального элемента. При описании чаще всего ее называют спиралью 12-го порядка, имея в виду тот факт, что на виток приходится 12 пар оснований. Шаг спирали Ъ-ДНК (высота витка) составляет величину 44.5-45.7 А и по диаметру она уже (18 А), чем А- и В-ДНК (ср. рис. 1.2 и 1.5).
Причиной чередования структур ступеней в 2-ДНК является разная конформация гликозидных связей у дезоксицитидина и дезоксигуанозина. Первый имеет обычную (как у А- и В-ДНК) конформацию анти, а второй -необычную сии (рис. 1.7). Именно это приводит к разному расстоянию фосфатов от оси и к зигзагообразному ходу линий, соединяющей
19
Рис. 1.7. Ориентация сахарных остатков по отношению к основанию при сип- и апти-конформапиях гликозидной связи в дсзоксигуанозинс и дезоксицитидине в г-ДНК.
последовательные атомы фосфора в цепи. Ось спирали в 2^ДНК смещена от центра пары в сторону минорного желобка (рис. 1.6). Поэтому он у г-ДНК -глубокий и узкий. Главного желобка у г-ДНК нет. На его месте формируется выпуклая поверхность — уникальная структурная особенность г-ДНК, о которой будет много говорится при рассмотрении результатов данной работы. Еще одна особенность, которая была отмечена в первых же кристаллографических исследованиях, - это разная ориентация у г-ДНК и правых спиралей А и В-типа «верха» и «низа» пары, что иллюстрирует рис. 1.8. В тех же работах отмечалось, что такая разница в ориентации пар приведет к нарушению стэкинга на границе В/г, поскольку пары с двух сторон такой границы будут “смотреть” в разные стороны (рис. 1.8), и следовательно, граница между Ъ- и В-ДНК будет энергетически не выгодна.
B-DNA
Z-CNA
8-DNA
Рис. 1.8. Разная ориентация пары в Z-ДНК и правых двойных спиралях на примере В-формы. Если центральный участок в четыре пары переходит в Z-конформацию, то это должно сопровождаться поворотом пар вокруг своей длинной оси на 180°, что иллюстрирует выход затемненного «низа» пары наверх. Из работы (Wang et al., 1979).
20
1.2.2 Чередующаяся пурин-пиримидиновая последовательность
фрагмента важна для образования Z-ДНК, поскольку энергетические расчеты показывают, что для пуринов анти- и сг/я-конформации приблизительно равновероятны, тогда как для пиримидинов сяя-конформация энергетически не выгодна (Hashmeyer & Rich, 1967). После открытия Z-ДНК сразу же возник вопрос о ее биологической роли, что стимулировало поиск областей с чередующимися пурин-пиримидиновыми участками в природных ДНК, а также белков, взаимодействующих с Z-формой и отличающих ее от других форм двойной спирали. Кроме того, исследователи задались вопросом о том, какие из чередующихся пурин-пиримидиновых последовательностей более «Z-любивы», чем другие, и какие модификации способствует повышению «Z-любивости» участка. Кристаллографы же, помимо изучения деталей структуры Z-ДНК и ее окружения, занялись исследованием других фрагментов, способных кристаллизоваться в виде Z-ДНК. Было показано, что кристаллы Z-ДНК образуются и в случае гексамера CGTACG с чередующейся последовательностью, включающей не только GC, но и AT-пары (Wang et al.,
1984). Было найдено, что Z-ДНК образуют и фрагменты с другими длинами, и несамокомплементарные фрагменты, и фрагменты, содержащие mismatch и модификации оснований (см. NDB и, например, обзор Dickerson, 1992). Наконец, кристаллографы задались вопросом о том, обязательно ли чередование пурин-пиримидин в последовательности фрагмента для образования Z-ДНК. В каноническом гексамере CGCGCG средняя ступень CG была заменена на ступени GG/CC (Schroth et al., 1993) или AT (Wang et al.,
1985), a в пятое положение цитозиновых оснований во фланкирующих ступенях введены метальные группы или атом брома для усиления общей Z-любивости фрагмента. В обоих случаях фрагменты образовали Z-ДНК, причем у двух центрачьных пар в стш-конформации оказались пиримидины в соответствии с общими требованиями структуры и обе пары оказались больше экспонированы наружу, чем в каноническом фрагменте CGCGCG. Таким
21
образом, было показано, что и при нарушении чередования пурин-пиримидин фрагмент может принимать Z-конформацию. В то же время выяснилось, что гексамер с чередующейся последовательностью принимает ее не во всех случаях. Например, практически такой же гексамер, как и канонический, но с последовательностью, начинающейся с пурина, GCGCGC, в кристаллах образует А-ДНК даже тогда, когда все его цитозиновые остатки метилированы (Mooers ct al., 1995). С другой стороны, если удлинить его до декамера GCGCGCGCGC, то в таком виде он опять образует Z-форму (Ban et al., 1996). Ну и наконец, тот же гексамер можно закристаллизовать как В-ДНК при замене одного из атомов кислорода фосфодиэфирной связи на атом серы (Cruse et al.,
1986). Исходя из совокупности изложенных фактов, можно сделать следующее предположение. По-видимому, короткие фрагменты ДНК сравнительно легко переходят из одной структурной формы в другую. Если это так, то в кристаллизационной среде, хотя и в разном соотношении, но представлены различные структурные формы. В процессе кристаллизации будет отбираться та из них, которая легче формирует кристалл. Очевидно, взаимодействия между молекулами, ответственные за образование кристалла, стимулируют такой отбор и, возможно, даже в ряде случаев способствуют самому структурному переходу. Ниже мы еще вернемся к этой гипотезе, а пока заметим, что она вполне объясняет изложенные выше факты с кристаллизацией сходных последовательностей CGCGCG и GCGCGC в виде Z- и А-ДНК или замену А-формы на Z при изменении длины фрагмента GCGCGC до декамера GCGCGCGCGC. Заметим также, что совсем недавно в виде Z-ДНК были закристаллизованы гексамеры CGGCCG (Eichmann et al., 1999) и CCCGGG (номер в HDB ZDF049). Таким образом, если какие-то взаимодействия in vivo способствуют образованию Z-формы, то она может образовываться не только на участках с чередующейся последовательностью. Тот факт, что впервые она была обнаружена у гексамера CGCGCG, лишь означает, что в данном случае последовательность и межмолекулярные взаимодействия способствовали