-2-
Оглавление
1 (ринятые сокращения....................................................................5
Введение................................................................................6
Глава 1. Флуоресценция фитопланктона (обзор литературы)................................10
1.1. Флуоресценция фитопланктона.....................................................10
1.1.1. Первичные процессы фотосинтеза..............................................10
1.1.2. Механизмы возникновения флуоресценция фитопланктона.........................12
1.1.3. Механизмы тушения флуоресценции. Кривая индукции флуоресценции..................................................................15
1.2. Флуоресцентные методы диагностики фитопланктона.................................18
1.2.1. Метод Pump and Probe........................................................19
1.2.2. Метод Fast Repetition Rate..................................................21
1.2.3. Метод Pump during Probe.....................................................22
1.2.4. Метод Pulse Amplitude Modulation............................................23
1.3. Метод нелинейной флуориметрии фитопланктона.....................................25
1.3.1. Особенности флуоресценции фитопланктона при
возбуждении 10-наносекундными лазерным импульсами..................................25
1.3.2. Метод нелинейной флуориметрии...............................................27
1.3.3. Модель формирования флуоресцентного отклика
фитопланктона при 10-наносекундном лазерном возбуждении............................28
Глава 2. Трёхпараметрическая модель формирования флуоресцентного отклика фитопланктона при 10-наносекундном импульсном лазерном
возбуждении............................................................................31
Введение.............................................................................31
2.1. Сечение возбуждения молекул хлорофилла-а а и эффективное
время жизни возбужденного состояния молекул хлорофилла-a т...........................32
2.2. Выбор значений параметров модели................................................34
2.3. Численный расчет а..............................................................36
2.4. Аналитическое выражение для а...................................................36
-3-
2.5. Численный расчет т.............................................................38
2.6. Аналитическое выражение для т..................................................38
2.7. Обсуждение результатов.........................................................40
Глава 3. Теоретическое исследование эффекта насыщения флуоресценции фитопланктона при импульсном лазерном
возбуждении...........................................................................46
Введение............................................................................46
3.1. Насыщение флуоресценции комплексов с высокой локальной
концентрацией молекул сложных органических соединений...............................50
3.1.1. Общие положения (по литературе)............................................50
3.1.2. Насыщение флуоресценции комплексов с высокой локальной концентрацией молекул сложных органических соединений при возбуждении лазерными импульсами с прямоугольным
распределением фотонов во времени и поперечном сечении пучка......................53
3.2. Насыщение флуоресценции фитопланктона при возбуждении
10-наносекундными лазерными импульсами..............................................58
3.3. Влияние пространственно-временного распределения возбуждающего лазерного импульса на кривую насыщения
флуоресценции фитопланктона.........................................................64
3.4. Решение обратной задачи нелинейпой флуоримстрии
фитопланктона.......................................................................68
Глава 4. Получение экспериментальных кривых насыщения
флуоресценции фитопланктона...........................................................74
4.1. Экспериментальная установка....................................................74
4.2. Методика получения кривых насыщения флуоресценции
фитопланктона.......................................................................79
4.3. Определение параметра А из экспериментальных кривых
насыщения флуоресценции фитопланктона...............................................83
4.3.1. Определение параметра А водоросли ТИаИазБ^га \Veisflogiis
находящейся в состоянии с открытыми реакционными центрами.........................83
4.3.2. Оценка ошибки определения параметра А......................................87
-4-
4.3.3. Оценка сверху параметра В водоросли ТИаПа^тоя^га Weisflogii, находящейся в состоянии открытыми
реакционными центрами.............................................................88
4.3.4. Влияние функционального состояния фитопланктона на
параметра А.......................................................................89
4.4. Сопоставление значений параметра А с литературными данными.....................96
Глава 5. Дистанционное зондирование прибрежной акватории лидаром
берегового базирования................................................................97
Введение............................................................................97
5.1. Учет ветрового волнения........................................................97
5.1.1. Модель ветрового волнения (по литературе)..................................98
5.1.2. Зависимость коэффициента возврата от угла зондирования.....................102
5.1.3. Расчет эхо-сигнала при дистанционном лазерном
зондировании......................................................................107
5.1.4. Натурные эксперименты......................................................109
5.2. Исследование возможности применения метода нелинейной флуориме грии фитопланктона при дистанционном лазерном
зондировании.......................................................................113
5.2.1. Расчет эхо-сигнала при дистанционном лазерном
зондировании с учетом насыщения флуоресценции фитопланктона......................113
5.2.2. Полученные результаты и их обсуждение.....................................117
Выводы...............................................................................123
Литература
125
Принятые сокращения
АЦП - аналого-цифровой преобразователь
ВП - вспомогательные пигменты
КР - комбинационное рассеяние
ОМА - оптический многоканальный анализатор
РЦ - реакционный центр
СОС - сложные органические соединения
ССА - светособирающая антенна
ССК - светособирающий комплекс
ФС1 - фотосистема 1
ФС2 - фотосистема 2
ФСБ - фогосинтетическая единица
ФСО - фотосинтезирующие организмы
ФП - фитопланктон
ФЭУ - фотоэлектронный умножитель
Хл-а - хлорофилл-а
FRR - Fast Repetition Rate
РАМ - Pulse Amplitude Modulation
PDP - Pump During Probe
Введение
Фотосинтезирующие организмы (ФСО) являются одним из важнейших компонентов биосферы, во многом определяющим состояние и функционирование глобальной экосистемы. ФСО являются источником кислорода и органического вещества на Земле.
Определение фотофизических параметров ФСО является центральной проблемой биофизики фотосинтеза. Во многом благодаря применению гтико- и фемтосекундной лазерной спектроскопии [1-4] - абсорбционной и флуоресцентной - достигнут большой прогресс в изучении процессов, протекающих на первичных стадиях фотосинтеза. Определены порядки величин многих фотофизических параметров. Такое состояние дел -хорошая основа для постановки еще более сложной задачи создания методов определения фотофизических параметров ФСО in situ дистанционно и эксирессно. Необходимость решения такой задачи диктуется в первую очередь потребностями экологического мониторинга. Однако продолжает оставаться актуальной и задача изучения влияния внешних факторов на фотофизнческие параметры ФСО. Решение этих задач с применением лазерной спектроскопии могло бы создать научную основу для разрабо тки дистанционного лазерного метода биоиндикации качества окружающей среды по изменению фотофизических параметров ФСО.
В диссертации исследования выполнены применительно к водным ФСО -фитопланктону (ФЛ). Как и другие классы ФСО, ФП флуоресцирует при оптическом возбуждении [5,6], что используется при изучении фотофизических процессов в клетках водорослей, а также для обнаружения и диагностики ФП.
В настоящее время существует ряд флуоресцентных методов (Pump and Probe [7-9], Fast Repetition Rate [10]), позволяющих in situ определять два фотофизических параметра ФП: фотосинтетическую активность Fv/Fm и сечение возбуждения фотосистемы 2 (ФС2) ops2- Однако эти методы не решают в полной мере задачи диагностики ФП. Поэтому целью работы является развитие еще одного подхода к определению фотофизических параметров ФП in situ- метода нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) [11-13].
В диссертационной работе решаются следующие задачи:
1. Построить и обосновать малопарамстричсскую модель, описывающую флуоресцентный отклик фитопланктона на его возбуждение 10-наносекундными лазерными импульсами со значениями плотности потока фотонов, лежащими в диапазоне Ю20*1025 см‘2с *.
2. Теоретически исследовать зависимости числа фотонов флуоресценции ФГ1 от плотности потока фотонов возбуждающего излучения (кривые насыщения флуоресценции ФП).
-7-
3. Провести экспериментальную проверку выводов теоретических исследований: получить кривые насыщения флуоресценции ФП и определить из них фотофизические параметры. Исследовать зависимость определяемых параметров от функционального состояния ФП.
4. Исследовать возможности применения метода нелинейной флуориметрии ФП в дистанционном режиме.
Содержание диссерт ации
Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы.
Во введении обосновывается актуальность темы диссертации, формулируются цель и задачи исследований, приводятся положения, выносимые на защиту, кратко излагается содержание диссертации.
13 первой главе на основе анализа литературы приводятся необходимые сведения об устройстве и функционировании фотосинтетичсского аппарата фитопланктона, описаны существующие на данный момент флуоресцентные методы диагностики фитопланктона, в том числе метод нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения).
Вторая глава посвящена созданию и обоснованию трехпараметрической модели формирования флуоресцентного отклика фотосинтезирующих организмов при их 10-наносекундном лазерном возбуждении. Параметрами модели являются: а - сечение возбуждения молекул хлорофилла-а (Хл-а), учитывающее как прямое поглощение свега этими молекулами, так и перенос энергии на них с молекул вспомогательных пигментов (ВП); т - эффективное время жизни молекул хлорофилла-а, учи тывающее все процессы дезактивации возбуждения кроме бимолекулярных (си нглет-синглетной аннигиляции); упо - максимальная скорость синглет-синглетной аннигиляции. Найдена связь параметров о и т с исходными фотофизическими параметрами (сечениями поглощения молекул пигментов, временами жизни их возбужденных состояний, скоростями межмолекулярного переноса возбуждений и т.д.).
В третьей главе приводятся результаты теоретического исследования эффекта насыщения флуоресценции фитопланктона. В квазистационарном приближении получены приближенные аналитические выражения для фактора насыщения Г в различных диапазонах изменения плотности потока фотонов р. Показано, что в рабочем диапазоне изменения Р фактор насыщения флуоресценции Г определяется параметром А=ат2упо. Сформулирована процедура одновременного определения ненасыщенного флуоресцентного параметра Ф0 и фотофизического параметра А из экспериментальной кривой насыщения флуоресценции.
-8-
В четвертой главе приводятся результаты экспериментальною исследования эффекта насыщения флуоресценции фитопланктона на примере монокультуры диатомовой водоросли 7йя//аш'сш>д \Veisflogn. Показано, что эксисриментачьные кривые насыщения флуоресценции водоросли ТИа11ах.ч1о.ч1га \Veisflogii хорошо согласуются с модельными. Из кривых насыщения флуоресценции водоросли Пм//Д.Ш0$/га \VeisJJogii определено значение параметра Л. Установлено, что параметр А зависит от функционального состояния водоросли.
Пятая глава посвящена исследованию возможности применения метода нелинейной флуориметрии фитопланктона в дистанционном режиме на примере зондирования прибрежных морских акваторий лидаром берегового базирования, когда угол зондирования б приближается к 90°. Угол зондирования 0 - это угол между лазерным лучом и нормалью к поверхности воды, в предположении, что последняя является горизонтальной плоскостью, иными словами угол между лазерным лучом и вертикалью. Показано, что ветровое волнение существенно увеличивает принимаемый эхо-сигнал по сравнению со случаем падения лазерного луча на плоскую поверхность. Приведены результаты натурных исследований на Черном море, дано описание созданного для этого лидара берегового базирования. Результаты исследований подтвердили выводы теории о возможности достижения дальности зондирования до ~1 км. Теоретически показана возможность реализации метода нелинейной флуориметрии фитопланктона в дистанционном режиме.
Научная новизна
Предложена трехпараметрическая модель, адекватно описывающая флуоресцентный отклик ФП при его возбуждении 10-наносекундными лазерными импульсами.
Показана возможность применения нового методического подхода для определения фотофизических параметров ФИ - метода нелинейной флуориметрии.
Впервые методом нелинейной флуориметрии определено значение парамсгра А монокультуры диатомовой водоросли ТИаИсяБюта \Veisflogii, находящейся в различных функционатьных состояниях.
Практическая ценность
Разработана методика определения ненасыщенного флуоресцентного параметра Фо (что позволяет после проведения катибровки определить концентрацию хлорофилла-а) и фотофизического параметра А, который может быть использован для диагностики состояния фитопланктона.
-9-
Создан и испытан в натурных условиях (на Черном морс) экспериментальный макет лидара берегового базирования; показана возможность осуществления с его помощью дистанционного мониторинга прибрежных акваторий протяженностью до 1 км с применением методов спектроскопии комбинационного рассеяния и флуориметрии.
Положения, выносимые на защиту:
1. Флуоресцентный отклик фитопланктона на его возбуждение 10-наносекундными лазерными импульсами может быть описан трехпараметрической моделью. Параметрами модели являются: а - сечение возбуждения молекул хлорофилла-a, учитывающее как прямое поглощение света этими молекулами, так и перенос энергии на них с молекул вспомогательных пигментов; т - эффективное время жизни молекул хлорофилла-а, учитывающее все процессы дезактивации возбуждения, кроме синглет-синглегной аннигиляции; упо - максимальная скорость синглет-синглегной аннигиляции возбужденных состояний молекул хлорофилла-а.
2. Методом нелинейной флуориметрии могут быть определены значения параметров Фо и А=<тт2упо. Параметр Ф» пропорционален концентрации хлорофилла-а. Параметр А зависит от функционального состояния ФП.
3. Метод нелинейной флуориметрии фитопланктона может быть реализован в дистанционном режиме, в том числе при зондировании прибрежных акваторий береговым лидаром, когда угол зондирования (угол между лазерным лучом и вертикалью) приближается к 90°. Ветровое волнение существенно увеличивает принимаемый эхо-сигнал по сравнению со случаем падения лазерного луча на плоскую поверхность.
Диссертационная работа выполнена на кафедре квантовой электроники Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Результаты работы докладывались на следующих конференциях: Международном симпозиуме «Environmental Sensing and Application» (Мюнхен, Германия, 1999 г.), 4-ой Международной конференции EARScL “Lidar Remote Sensing of Land and Sea" (Дрезден, Германия, 2000 г.), Третьей Всероссийской конференции «Физические проблемы экологии (экологическая физика)» (Москва, 2001 г.), XIV Международной конференции по когерентной и нелинейной оптике ICONO-01 (Минск, Белоруссия, 2001 г.), Международной конференции молодых ученых по квантовой электронике IQEC/LAT-YS 2002 (Москва, 2002 г.).
По теме диссертации опубликовано 4 статьи в реферируемых журналах [64,83,99,100], 4 статьи в сборниках трудов конференций [65,75,84,101] и 1 тезис доклада [77].
- 10-
Глава 1. Флуоресценция фитопланктона (обзор
литературы)
1.1. Флуоресценция фитопланктона
1.1.1. Первичные процессы фотосинтеза
Фотосинтез - это многостадийный процесс, в котором энергия света видимою диапазона превращается в энергию химических связей. В последние два десятилетия вышло большое число монографий и учебников (см., например, [14-17]), посвященных фотосинтезу.
На начальной (световой) стадии свет поглощается молекулами свстособирающсй антенны (ССА), а затем происходит перенос энергии возбуждения к особому, связанному с мембраной пигмент-белковому комплексу, называемому реакционным центром (РЦ). В РЦ происходит первичная фотохимическая реакция - индуцированный светом перенос электрона от первичного донора к первичному акцептору. У зеленых растений процессы фотохимического разделения зарядов происходят в двух фотосистемах, последовательно включенных в цепь электронного транспорта [14,15], осуществляющую перенос электронов от воды к НАДФ+. Все основные экспериментальные данные хорошо описываются в рамках классической 2-схемы фотосинтеза [14,15].
Попавший на РЦ фотосистемы 2 экситон переводит в возбужденное состояние первичный донор электрона Р680 (в дальнейшем просто Р, по всей видимости, молекула хлорофилла-а или ее димер), после чего происходит разделение зарядов между Р и промежуточным акцептором I (феофитином) и передача электрона последовательно на <)а и ()ь - стабильные первичный и вторичный акцепторы (молекулы иластохинона) [14,15]. Рассмотренные процессы можно описать следующей цепочкой:
>00 „с , р,0г0ь 03 „с , р(даС,-
Восстановление Р+ происходит вторичным донором электрона 7, (тирозин), который в свою очередь принимает электрон от кислород-выделяющего комплекса:
грчег — >г'рк)~ (1.2).
Время этого процесса сильно зависит от состояния кислород-выделяющего комплекса (так называемый цикл §0-84 состояний [18]) и варьируется от 30нс до Юмкс. На схеме показано некоторое среднее время - 300 не. В течение 80-84 цикла происходит 4 последовательных
-11 -
акта фотохимического разделения зарядов в РЦ ФС2 с выделением одной молекулы кислорода Ог и окислением двух молекул воды ІЬО: 2Н20 —4?-~ > 4е~ + 4Н' + 02.
Перенос электрона от Ца на Ць происходит за время порядка 200-300мкс [14,15]. Электрон, попавший на пластохиион Qb, находится такі до попадания следующего экситона на РЦ, и цепочка повторяется, при этом Ц^ принимает второй электрон от Ц~ и отрывается
ог белка, с которым он был связан. Отрицательный заряд нейтрализуется путем захвата двух протонов из внсгилакоидного пространства. Восстановленная таким образом молекула пластохинола ЦЬН2 покидает свое место, и освободившееся место заполняется пластохиионом из мембранного пула РЦ, после чего цикл двухэлектронного восстановления Ць возобновляется.
Восстановленная молекула ЦьН2 диффундирует к внутренней стороне мембраны. Дальнейшие участники электрон-транспортной цепи (железо-серные центры, циіохром Ґ, пласгоцианин) осуществляют перенос электронов от ЦЬН2 к окисленному в результате фотохимического акта первичному донору РЦ фотосистемы 1 (ФС1), акцепторы которой восстанавливают молекулу ПАДФ'. Образовавшиеся в результате окисления ЦЬН2 два
протона ухолят во внутритилакоидное пространство, а окисленная молекула пластохиноиа Ць возвращается к внешней стороне мембраны в пул хинонов РЦ. Суммарное время, требуемое для переноса электрона от воды к конечному акцептору НАДФ+, составляет 1-10 мс [7].
Кроме тот, существует возможность так называемого циклического транспорта электронов, когда акцепторы ФС1 осуществляют перенос электронов не на молекулу НАДФ+, а в пул хинонов. В результате переноса электрона через пул хиноиов назад (к донорнон стороне ФС1) происходит перенос еще одного протона во внутритилакоидное пространство.
Протоны, попавшие во внугритилакоиднос пространство в результате транспорта электронов (циклического или нециклического) через пул хинонов и восстановления первичного донора РЦ ФС2 (с выделением кислорода), используются в дальнейшем для образования молекул АТФ из молекул АДФ.
В течение световой стадии фотосинтеза происходят 4 последовательных фотоакта (в каждой из фотосистем) и осуществляется перенос 4 электронов от воды к НАДФ*, в результате чет окисляются 2 молекулы воды, восстанавливаются 2 молекулы ІІАДФ* (для восстановления одной молекулы ІІАДФ' требуется 2 электрона) и образуются 1 молекула кислорода О2 и 3 молекулы АТФ.
- Київ+380960830922