ВВЕДЕНИЕ
6
ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ РЕНТГЕНОВСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ОРГАНИЧЕСКИХ И БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСГЕМ
1.1. Упорядоченные органические и биоорганические наностистемы: свойств, применение и методы формирования.......................24
1.1.1. Белково-липидные пленки как модели клеточных мембран.....24
1.1.2. Метод Ленгмюра-Блоджетт..................................27
1.1.3. Формирование биоорганических пленок на поверхности жидкой субфазы ........................................................30
1.1.4. Нанесение биоорганических пленок на твердые подложки.....39
1.2. Рентгеновские исследования молекулярных пленок на жидкости...43
1.3. Метод длинно периодических стоячих рентгеновских волн......51
1.3.1. Основные принципы........................................51
1.3.2. Стоячие рентгеновские волны в многослойных периодических структурах......................................................53
1.3.3. Метод стоячих рентгеновских волн для исследования органических и биоорганических наносистем......................................57
ГЛАВА И. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ ПО ИЗУЧЕНИЮ ТОНКОПЛЕНОЧНЫХ НАНОСИСТЕМ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН
2.1. Метод рекуррентных уравнений...............................64
2.1.1. Схема расчета рентгеновского отражения от многослойной системы 2.1.2 Расчет интенсивности волнового поля.......................68
2.1.3. Расчет интенсивности выхода вторичных излучений..........72
2.2. Метод СРВ для исследования тонких пленок в условиях полного
внешнего отражении............................................73
2.3. Особенности рассеяния рентгеновского излучения в мономолекулярных пленках на поверхности жидкости..............81
ГЛАВА III. РАЗВИТИЕ МЕТОДА СРВ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ УПОРЯДОЧЕННЫХ НАНОСИСТЕМ НА ЖИДКОСТИ
3.1. Введение.................................................86
3.2. Особенности рентгеновских измерений на жидкости..........89
3.3. Описание экспериментальной станции ID10, ESRF, Франция...94
3.4. Структурная нанодиагностика ленгмюровских слоев на поверхности
жидкости с помощью метода СРВ................................104
ГЛАВА IV. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРИМЕСНЫХ ИОНОВ В ПЛЕНКАХ
ЛЕГМЮРА-БЛОДЖЕТТ НА ТВЕРДЫХ ПОДЛОЖКАХ
I
4.1. Введение................................................115
4.2. Описание экспериментальной станции КМС-2, BESSY II,
Германия.....................................................116
4.3. Нанесение ЛБ пенок на основе фосфолипидов и
жидкокристаллических соединений на твердые подложки..........118
4.4. Исследования морфологии поверхности органических пленок методом атомно-силовой микроскопии...........................122
4.5. Изучение структурных нарушений в фосфолиниднмх бислоях под действием ионов тяжелых металлов.............................125
4.6. Структурная локализация следовых количеств примесных ионов в пленках Лэнгмюра-Блоджстт на основе жидкокристаллических соединений...................................................128
3
ГЛАВА V. ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН
5.1.Введени е................................................140
5.2. Комнлсксообразующис соединения как ускорители выведения тяжелых .металлов из организма...............................141
5.3.Формирование упорядоченных белковых пленок на твердых подложках....................................................144
5.4. Исследования морфологии поверхности белковых пленок методом атомно-силовой микроскопии...................................155
5.5. Исследования молекулярных механизмов действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наносистем в качестве изолированных моделей клеточных мембран......................159
5.6. Сравнительная оценка действия лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов.........163
5.7. Изменения композиционного состава и молекулярной организации изолированных мембранных моделей при применении лекарственных препаратов в высоких дозах...................................172
ГЛАВА VI. МЕТОД СТОЯЧИХ РЕНТГЕНОВСКИХ ВОЛН ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА И МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БИООРГАНИЧЕСКИХ НАНОСИСТЕМ НА ПОВЕРХНОСТИ ЖИДКОСТИ
6.1. Введение................................................182
6.2. Исследование процессов самоорганизации в смешанных белковолипидных пленках на основе щелочной фосфатазы................183
6.2.1. Формирование белково-липидной пленки на основе щелочной фосфатазы на поверхности .жидкости...........................183
6.2.2. Изучение элементного состава белковых пленок..........184
4
6.2.3. Исследования молекулярной организации белковных пленок методом стоячих рентгеновских волн....................................186
6.3. Исследования механизмов нарушения белково-линиднмх взаимодействий под влиянием повреждающих агентов..............195
6.3.1. Формирование белковой пленки на основе глюкозооксидазы на поверхности жидкости..........................................196
6.3.2. Исследования пленок на основе глюкозооксидазы, обработанной растворами солей свинца и хрома...............................196
6.3.3. Исследования пленок на основе глюкозооксидазы, подвергнутой обработке мочевиной...........................................201
ЗАКЛЮЧЕНИЕ....................................................210
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................214
5
ВВЕДЕНИЕ
Создание новых методов формирования и изучения высокоорганизованных органических и биоорганичсских тонкопленочных систем представляет собой одно из важнейших направлений научных разработок в области нанотехнологий. Возможность модифицировать физические и химические характеристики таких систем в широких пределах позволяет получать тонкопленочные покрытия нанометрового диапазона с заранее заданными и самыми разнообразными свойствами. Важнейшей сферой практического применения органических пленок является молекулярная микроэлектроника. Использование биоорганичсских пленок открывает новые перспективы для различных биотехнологических приложений, к числу которых относится получение активных элементов для биосенсоров, разработка биокатализаторов, создание синтетических нанобиоструктурных материалов для биомедицинских применений и т.д.
Особый интерес к исследованию упорядоченных белково-липидных пленок связан с тем, что по своему составу и морфологии эти системы представляют собой адекватную модель биологических мембран. Такие исследования позволяют получать информацию о структурнофункциональном состоянии белково-липидных моделей клеточных мембран на молекулярном уровне и могут быть эффективно использованы для решения широкого круга задач, связанных с биомедицинской диагностикой и биофизическими исследованиями. Новые перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области биологии и медицины открывает изучение белково-липидных пленок на поверхности жидкой субфазы, когда не нарушается нативная конформация белковых молекул, а, следовательно, сохраняются их биологические функции. Это дает принципиальную возможность изучать различные биофизические и биохимические процессы, протекающие в функционирующих мембранных моделях.
Дальнейшее расширение границ применения органических и биоорганичсских слоистых наноструктур тесно связано с развитием новых
6
физических методик для характеризации объектов, имеющих ианоразмерпую организацию. К числу наиболее перспективных современных методов диагностики тонкопленочных систем относятся рентгеновские методики, дающие спектрально-селективную структурную информацию, такие как метод стоячих рентгеновских волн (СРВ). Исследования тонкопленочных биоорганических систем с помощью метода СРВ основаны на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей в условиях полного внешнего отражения (ПВО). Главным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими методиками является возможность напрямую определять местоположение атомов определенного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.
Важным шагом в развитии метода СРВ явиляется применение этого метода для исследования органических и биоорганичсских пленок на жидкости, что потребовало решения целого ряда аппаратурно-методических задач, связанных с реализацией рентгенофлуоресцентных измерений при неподвижном положении образца. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ, исследования органических слоев на жидкости с помощью рентгенофлуоресцентных измерений носят единичный характер. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на монослой, нанесенный на поверхность водной субфазы.
Целью настоящей работы являлось развитие метода стоячих рентгеновских волн в области полного внешнего отражения для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на твердых подложках и на поверхности жидкости. Работа включала в себя решение следующих задач:
■ Разработка методики рентгенофлуоресцептных измерений в области полного внешнего отражения для изучения элементного состава и
7
структурной организации молекулярных пленок, сформированных на поверхности жидкости;
Проведение исследований органических и биоорган ических
наносистем на жидкости и на твердых подложках;
Теоретический анализ особенностей рассеяния рентгеновского излучения в планарных наносистемах в условиях полного внешнего отражения;
Создание математических подходов для обработки экспериментальных данных по нанодиагностике молекулярных пленок на жидкости с применением метода стоячих рентгеновских волн.
Научная новизна. В ходе работы впервые:
Метод СРВ экспериментально реализован для исследования композиционного состава и структурной организации мономолекулярных слоев, сформированных на поверхности жидкости.
Теоретически изучены особенности волновых полей, формирующихся в слаборасссивающих органических пленках в условиях полного внешнего отражения. Получено аналитическое выражение для интенсивности выхода флуоресценции от мономолекулярного слоя в приближении линейного затухания эвансцентной волны.
Исследованы процессы самоорганизации, протекающие в белковолипидных пленках на поверхности жидкости, в условиях, когда липидные и белковые молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. Продемонстрированы принципиально новые возможности, которые открывает применение метода СРВ для изучения белково-липидных моделей биологических мембран в
условиях максимально приближенных к условиям их функционирования в живой клетке.
4. Экспериментально и теоретически изучено явление резонансного усиления волнового поля в биоорганических наноструктурах, сформированных на поверхности жидкости.
5. Получена новая информация о молекулярных механизмах повреждающего действия токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина) на белково-липидные модели биомембран, сформированные на поверхности жидкости и на твердых подложках.
6. Экспериментально обнаружено явление самопроизвольной адсорбции ионов металлов из воды высокой степени очистки к белковым макромолекулам в результате конформационных перестроек, вызванных действием различных ксенобиотиков (токсические вещества и лекарственные препараты).
7. Метод СРВ применен для изучения молекулярных механизмов действия лекарственных соединений. Предложен новый подход для исследования эффективности и безопасности действия лекарственных соединений с использованием белково-липидных наноструктур в качестве изолированных моделей клеточных мембран.
Практическим значимость. Результаты работы представляют собой научно-методическую основу для спектрально-селективной структурной диагностики органических и биоорганических наносистем на жидкости и на твердых подложках.
■ Развито новое направление в применении метода СРВ — изучение композиционного состава и молекулярной организации органических и биоорганических пленок, сформированных на поверхности жидкой субфазы. Научный задел по нанодиагностике белково-липидиых пленок на жидкости с применением спектрально-селективных
рентгеновских измерений позволит существенно расширить возможности биофизических исследований, посвященных изучению структурно-функциональных свойств клеточных мембран.
Разработана методика измерения угловой зависимости выхода флуоресценции от молекулярных пленок в условиях полного внешнего отражения, позволяющая избежать искажений сигнала, связанных с изменением положения области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.
На примерах исследований белково-липидных пленок на жидкой субфазе показаны новые возможности метода СРВ для изучения молекулярной организации, а также механизмов функционирования биологических мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку.
Предложен метод контроля эффективности и безопасности действия лекарственных препаратов, позволяющий получать
дифференциальные данные о механизмах действия лекарственного соединения в отличие от интегральных результатов исследований на целостном организме.
Получена сравнительная оценка действия лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер и ксидифон), применяемых для лечения острых и хронических интоксикаций тяжелыми металлами.
Разработаны численные и аналитические подходы для математической обработки и интерпретации результатов эксперимента по изучению структуры органических и биоорганических тонкопленочных наносистем на жидкости с помощью метода СРВ.
Положения, выносимые на защиту:
Разработка методических основ для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкости с применением метода СРВ в
области полного внешнего отражения. Главным преимуществом разработанной методики является возможность получать спектрально-селективную структурную информацию о динамичных двумерных системах, формирующихся в результате самопроизвольной организации молекул на межфазной границе жидкость/воздух. Результаты экспериментальных и теоретических исследований рассеяния рентгеновского излучения на органических и биоорганических планарных наносистсмах в условиях полного внешнего отражения: особенности интерференционных волновых полей, формирующихся в слаборассеивающих пленках в условиях резонансного усиления; обнаруженные аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких пленок; закономерности выхода вторичных излучений от мономолекулярных слоев на жидкости.
Результаты т-яки исследований процессов самоорганизации в биоорганических наносистемах на жидкости в условиях, когда белковые и липидные молекулы обладают высокой молекулярной подвижностью. В том числе: изучение самопроизвольного расслоения термодинамически неустойчивых белково-липидных наносистем; выявление молекулярных механизмов нарушения белково-липидных взаимодействий в биоорганических наносистемах под действием токсических веществ (тяжелые металлы и мочевина).
Развитие метода СРВ для исследований молекулярных механизмов действия лекарственных препаратов с использованием белковолипидных наносистсм в качестве изолированных моделей клеточных мембран. Полученные методом СРВ данные об эффективности комплексообразующих лекарственных препаратов, применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма.
Обнаруженное явление адсорбции ионов металлов на органические и биоорганические молекулы из водной субфазы, содержащей примеси
о
в следовых количествах (в концентрации меньше 10' М). Полученные методом СРВ данные о повреждении молекулярной организации пленок Ленгмюра-Блоджетт в результате адсорбции ионов металлов; результаты исследований влияния различных ксенобиотиков (тяжелые металлы, лекарственные соединения, мочевина) на увеличение способности белковых молекул адсорбировать ионы металлов.
Личный вклад автора состоит в постановке и организации всех исследований, непосредственном участии в проведении рентгеновских измерений, обработке данных, интерпретации и изложении результатов.
Апробации работы. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих конференциях: Национальные конференции по применению рентгеновского, синхротроиного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (РСНЭ), Москва 1997, 1999, 2003, 2005, 2007, 2009; Конференция «Рентгеновская оптика-99»,
Н.Новгород 1999; XVIII международный кристаллографический конгресс, Глазго 1999; Международная конференция «Самоорганизация на границах раздела и в тонких пленках», Гренобль 2000; XII Международная конференция «Малоугловое рассеяние» Венеция 2002; XVII Международный конгресс «Рентгеновская оптика и микроанализ» (1СХОМ), Шамони-Монблан 2003; XXIV Европейская кристаллографическая конференция (ЕСМ-24), Маракеш 2007; Международные конференции «Рентгенофлуоресцентный анализ в области полного внешнего отражения» (ТХЯЕ), Вена 2000, Будапешт 2005, Тренто 2007, Гетеборг 2009; Четвертая международная конференция «Нанобио- и другие новые и перспективные технологии», Пущино 2007; Второй Международный форум по нанотехнологиям, Москва 2009; III Научно-практическая конференция «Современные технологии и методы диагностики различных групп заболеваний, лабораторный анализ», Москва 2010; XIV Национальная конференция по росту кристаллов (НКРК), Москва 2010.
12
Диссертация состоит из шести глав, введения и заключения.
Глава I носит обзорный характер и посвящена изложению современного состояния исследований в области упорядоченных органических и биоорганических пленок, а также развитию рентгеновских методик для диагностики такого рода объектов.
Нанотехнологии сегодня интенсивно используют процессы молекулярной и супрамолекулярной организации для создания новых структур, обладающих заранее заданными свойствами; развиваются все новые подходы к конструированию материалов, основанные на субмикронной «сборке» при использовании принципов самоорганизации вещества. Одним из наиболее эффективных методов создания упорядоченных органических наносистем является метод Ленгмюра-Блоджетт (ЛБ), позволяющий контролировать организацию слоистых систем на молекулярном уровне. Основа метода была разработана в 30-х годах 20 века ИЛенгмюром и его сотрудницей К.Блоджетт.
Первая попытка нанесения белковых монослосв (на основе пепсина и уреазьт) была предпринята еще И.Ленгмюром. Новая волна интереса к белковым пленкам возникла в 80-х годах 20 века, когда были получены функциональные упорядоченные биоорганические пленки толщиной в одну молекулу, и продемонстрирована возможность применения таких пленок в качестве активных элементов биосенсорных устройств. Тонкие пленки на основе ферментов используются в биологии, биохимии и медицине с диагностической целью.
Расширение границ применения молекулярных пленок в сфере фундаментальных и прикладных исследований тесно связано с развитием новых физических методик, позволяющих контролировать наноархитектуру органических и биоорганических планарных систем на молекулярном уровне. Естественно, что различные поверхностно-чувствительные рентгеновские методы, такие как рефлектометрия, двумерная поверхностная дифракция и др., получившие дополнительные экспериментальные
возможности с использованием источников синхротронного излучения, все более активно привлекаются для изучения молекулярных пленок.
Сравнительно недавно, благодаря созданию рентгеновских спектрометров, оснащенных ленгмюровской ванной, начался новый этап в развитии рентгеновских исследований молекулярных пленок. В настоящее время структурная диагностика органических и биоорганических наносистем на жидкости представляет собой важную интенсивно развивающуюся область рентгеновских исследований с применением всего арсенала современных поверхностно чувствительных методик.
Рентгеновские исследования молекулярных пленок на жидкости развиваются, главным образом, по двум направлениям. Первое направление основано на использование двумерной дифракции в скользящей геометрии, когда вектор рассеяния направлен параллельно поверхности пленки. Рснтгеиодифракционные измерения в такой геометрии позволяют изучать кристаллическую структуру двумерных молекулярных систем вдоль поверхности и являются наиболее широко применяемым методом исследования органических пленок на поверхности жидкости.
Второе направление рентгеновских исследований на жидкости связано с измерениями в стандартной геометрии, когда вектор рассеяния направлен перпендикулярно к поверхности, что позволяет получать информацию о распределении профиля рассеивающей плотности вдоль нормали к поверхности. Это направление базируется на достижениях рентгеновской рефлектометрии и позволяет с атомной точностью локализовать отдельные химические компоненты молекулярной пленки но ее толщине.
Особое место в ряду рентгеновских методик занимает метод СРВ. Метод СРВ основан на одновременной регистрации рентгеновского отражения и выхода вторичного излучения (например, характеристической флуоресценции), возникающего при неупругом рассеянии рентгеновских лучей. Важным преимуществом метода СРВ по сравнению с классическими рентгеновскими исследованиями является возможность напрямую определять
14
местоположение атомов данного сорта в слоистой системе из анализа угловых зависимостей выхода флуоресценции от этих атомов.
Первые работы по применению метода СРВ появились около 40 лет назад. Эти исследования были посвящены изучению совершенных кристаллов полупроводников. Новый импульс в своем развитии метод СРВ получил около 20 лет назад с появлением высокоинтенсивных источников рентгеновского излучения - синхротронов, что дало возможность применить метод СРВ для исследования слаборассеивающих тонких приповерхностных слоев, а также границ раздела между кристаллом и тонкой эпитаксиальной пленкой.
Одно из направлений в использовании метода СРВ связано с изучением структуры и композиционного состава сложноорганизованных тонкопленочных наноматериалов, таких как биоорганическис слоистые наносистемы, органические молекулярные и полимерные пленки, нанесенные на твердые подложки, и т.д. Широкие возможности метода СРВ для характеризации ЛБ пленок на твердой подложке были продемонстрированы в целом ряде работ [1-4]. Важным шагом в развитии метода СРВ является применение рентгенофлуоресцентных измерений для исследований биоорганических слоев на жидкости, что позволит получать новые знания о свойствах, принципах функционирования и молекулярной организации белково-липидных моделей клеточных мембран в физиологических условиях и при патологических воздействиях на клетку. Несмотря на огромный потенциал метода СРВ для нанодиагностики органических и биоорганических пленок на жидкости, реализация этих исследований продолжает оставаться малодоступной широкому кругу экспериментаторов из-за серьезных инструментальных и экспериментально-методических проблем [5, 6]. К началу настоящей работы существовали лишь две публикации американских и французских ученых по изучению процессов сегрегации ионов металлов из водной субфазы на монослой жирной кислоты, нанесенный на поверхность водной субфазы.
15
В главе II предложены математические подходы для анализа экспериментальных данных по изучению тонкопленочных наносистем с помощью метода СРВ.
Для математической обработки экспериментальных результатов был использован метод рекуррентных соотношений, впервые предложенных Парраттом. В рамках этого подхода предполагают, что каждый слой многослойной системы имеет однородную структуру, а границы раздела слоев являются достаточно резкими, при этом граничные условия сводя тся к условиям непрерывности тангенциальных компонент электрического и магнитного полей на границах раздела слоев, составляющих многослойную систему. Решая систему рекуррентных соотношений можно получить численно угловое распределение интенсивности рентгеновской волны как на выходе из слоистой структуры, так и в ее объеме, причем в общем случае, включая область полного внешнего отражения (ПВО) и не ограничиваясь приближением слабого рассеяния одним периодом. Кроме того, данный подход позволяет изучать произвольные структуры, в том числе не являющиеся периодическими. Рассмотренная схема численного моделирования была использована для проведения расчетов угловой зависимости интенсивности отражения рентгеновских лучей и выхода флуоресценции и математической обработки экспериментальных данных.
Проведен анализ особенностей применения метода СРВ для изучения органических и биоорганических пленок в условиях ПВО. Показано, что хотя толщина таких пленок мала, а электронная плотность низкая, в области малых углов (при углах меньше критического угла ПВО для подложки вс) изменения волнового поля, вызванные присутствием пленки, могут быть существенными. Для случая слаборассеивающих пленок, когда справедливо приближение линейного затухания эванесцентпой волны, получено аналитическое выражение для интенсивности волнового поля [6, 7]. Показано, что в таком приближении изменения волнового поля целиком определяются поверхностной электронной плотностью пленки.
16
Установленные закономерности представляют особый интерес для исследования молекулярных пленок на поверхности жидкости. Действительно, если химический состав молекул известен, т.с. число электронов в одной молекуле задано, то величина поверхностной электронной плотности пленки будет целиком определяться значением площади, занимаемой одной молекулой в пленке 5ма1. Особенность исследования ленгмюровских пленок на поверхности жидкости состоит в том, что величину 5»,,,» можно оценить из изотермы сжатия независимо от рентгеновских измерений, что позволяет свести к минимуму число неизвестных параметров при подгонке экспериментальных кривых выхода флуоресценции. Согласно полученным формулам, если поверхностная электронная плотность пленки известна, то форма флуоресцентной кривой зависит только от расстояния И от атомов до границы раздела пленка/подложка. Таким образом, анализ экспериментальных данных но измерению выхода флуоресценции от мономолекулярных пленок на поверхности жидкости дает принципиальную возможность свести проблему определения местоположения атомов в пленке к решению однопараметрической задачи.
Глава III посвящена развитию метода СРВ для исследования упорядоченных наноструктур на жидкости. В отличие от исследований твердых образцов, в измерениях на жидкости положение образца (ленгмюровской ванны) должно оставаться горизонтальным. Поэтому для изменения угла между падающим пучком и поверхностью образца приходится отклонять падающий пучок от горизонтальной плоскости. В такой схеме проведения эксперимента меняется положение области засветки на поверхности жидкости при изменении угла падения. В связи с этим, в рентгеновских измерениях на жидкости изменяют положение ванны по высоте: зная геометрические параметры станции можно рассчитать, на сколько следует поднять или опустить ванну, чтобы при изменении угла
17
положение области засветки па поверхности жидкой субфазы оставалось неизменным.
Специфика измерений методом стоячих рентгеновских волн состоит в том, что в этих экспериментах регистрируют флуоресцентные сигналы крайне низкой интенсивности, которые приходится подолгу копить. При этом уровень жидкости в ленгмюровской ванне неконтролируемым образом изменяется из-за испарения с поверхности водной субфазы. Поэтому при длительных измерениях коррекцию положения ленгмюровской ванны по высоте следует вести в режиме непрерывного мониторинга. В настоящих исследованиях была применена специальная методика измерения угловой зависимости интенсивности выхода флуоресценции, позволяющая избежать искажений интенсивности флуоресцентного сигнала, возникающих в процессе проведения исследований из-за изменения положения центра области засветки рентгеновским пучком на поверхности жидкой субфазы.
Рентгеновские измерения были выполнены на экспериментальной станции ГО10В в Европейском Центре Синхротронного Излучения (Франция). В качестве первого шага модельными объектами исследования были выбраны поверхностно-активные органические соединения, образующие стабильные упорядоченные лэнгмюровские слои на
поверхности жидкости: металлозамещенные фталоцианины,
полиорганосилоксаны и фосфолипиды [6-8]. На этих органических наносистемах впервые экспериментально были получены угловые
зависимости выхода флуоресценции от единичного монослоя на поверхности жидкости. Продемонстрированы возможности метода СРВ в области полного внешнего отражения для определения местоположения ионов внутри органического монослоя. Анализ угловых зависимостей выхода позволил определить упаковку молекул в ленгмюровских слоях металозамещенпых фталоцианинов и полиорганосилаксанов.
В главе IV представлены результаты исследований повреждения молекулярной организации многослойных Л В пленок в результате
18
инкорпорирования ионов металлов из водной субфазы. Экспериментальные измерения были проведены на источнике синхротронного излучения ВЕББУ (Германия), станция КМС-2. Методом СРВ была получена информация о композиционном составе и характере распределения примесных ионов в ЛЬ пленках фосфолипидов и жидкокристаллического комплекса европия, нанесенных на кремниевые подложки [11, 12, 14].
Для приготовления пленок монослой фосфолипида формировали на водной субфазе, содержащей ионы свинца, а затем переносили на гидрофобную кремниевую подложку методом вертикального лифта. Впервые зарегистрированы аномалии в экспериментальных угловых зависимостях выхода флуоресценции от тонких упорядоченных пленок в угловой области полного внешнего отражения: обнаружено, что кривая выхода флуоресценции от ионов свинца повторяет форму угловой зависимости отражения рентгеновских лучей И описывается соотношением 1+Рь где Р/І интенсивность отраженного рентгеновского пучка. Такая форма угловой зависимости, по-видимому, объясняется тем, что атомы-источники флуоресцентного излучения в пленке не образуют сплошного слоя. В этом случае, нарушается основное допущение, используемое в рамках метода рекуррентных соотношений - распределение атомов-источников вторичного излучения можно рассматривать как однородные слои. Для «несплошных» слоев становится неправомерным использование рекуррентных соотношений, а значит, должны нарушаться общие закономерности, наблюдаемые в рамках этого подхода для угловых зависимостей выхода флуоресценции от тонких пленок. Одной из возможной причин такого рода угловой зависимости выхода флуоресценции в измерениях на ЛБ пленках фосфолипидов может быть то, что свинец в бислое фосфолипида присутствует в виде отдельных частиц, которые образуются под монослоем фосфолипидов в процессе формирования слоя на водной субфазе.
В экспериментах по исследованию многослойных систем на основе жидкокристаллического соединения благодаря преимуществам
19
рентгенофлуоресцентных измерений в области ПВО было обнаружено явление самопроизвольного связывания органическими молекулами ионов металлов из воды высокой степени очистки (содержание примесей ниже 10‘7-
Л
10' М). Анализ угловых зависимостей выхода флуоресценции позволил локализовать положение ионов металлов, инкорпорированных в органические слои из водной субфазы в процессе нанесения пленок. Установлено, что, даже в том случае, когда примеси присутствуют в водной субфазе в следовых концентрациях (ниже чем 10‘7 М.), самопроизвольная адсорбция органическими молекулами ионов металлов привела к значительным перестройкам молекулярной организации пленок: в процессе инкубирования слоя комплекса европия на водной субфазе, произошло фазовое разделение слоя.
Полученные результаты экспериментальных исследований нарушений структурной организации ЛБ пленок, вызванных адсорбцией ионов металлов из водной субфазы, наглядно демонстрируют преимущества метода СРВ, в котором спектральная селективность сочетается с возможностью получения структурной информации.
Глава V. На основе метода стоячих рентгеновских волн предложены новые подходы для исследования эффективности и безопасности лекарственных соединений с использованием белково-липидных наносистем на твердых подложках в качестве изолированных моделей клеточных мембран [9, 10, 16, 17]. Получена сравнительная оценка действия четырех лекарственных препаратов (ЭДТА, сукцимер, кси дифон и медифон), применяемых для ускорения выведения тяжелых металлов из организма человека. Экспериментальные измерения были выполены на источнике синхротронного излучения BESSY (Германия), станция КМС-2.
Проведены исследования элементного состава и молекулярной организации белково-липидных пленок на основе ферментов Са-АТФаза и щелочная фосфатаза, предобработанных раствором свинца, а затем подвергнутых действию комплексообразующих препаратов. Анализ
20
I
экспериментальных угловых зависимостей выхода флуоресценции от ионов свинца позволил напрямую определить положение ионов свинца в пленках до и после применения комплексообразующих препаратов. Получены новые данные об изменениях элементного состава белково-липидных пленок при использовании комплексообразующих препаратов в высоких дозах.
Установлено, что в случае изолированной белково-липидной пленки применение исследованных комплексообразующих лекарственных препаратов ЭДТА, сукцимера и ксидифона дает возможность максимально, но не полностью удалить из молекул ферментов Са АТФаза и щелочная фосфатаза ионы свинца, связанных в процессе преинкубации белка в растворе свинца. Показана высокая эффективность огечествениго бифосфонового комплексообразующего соединения — ксидифона, не уступающая по элиминирующим свойствам патентованным комплексонам ЭДТА и сукцимер.
Обнаружено, что в результате обработки белковых молекул растворами комплексообразующих препаратов высокой концентрации, а также раствором свинца, изменяется конформационное строение белков, что способствуют появлению в них новых центров связывания ионов металлов. Значительное увеличение адсорбционной способности белковых молекул раскрывает один из возможных механизмов нарушения микроэлементного баланса в организме, вызванного действием высоких доз лекарственных препаратов или токсических веществ: накопление в белковых молекулах ионов металлов обусловливает выключение жизненно важных микроэлементов из обменных процессов, тем самым, являясь причиной возникновения таких серьезных заболеваний как микроэлементозы.
Продемонстрированы возможности метода стоячих рентгеновских волн для изучения белково-липидных мембранных моделей на твердых подложках. Показана принципиальная возможность применения современных структурно-чувствительных рентгеновских методик для развития новых методов контроля эффективности лекарственных препаратов
21
- Київ+380960830922