СОДЕРЖАНИЕ
Введение.........................................................................7
Глава I. Обзор литературы....................................................... 11
1.1. Строение и состав хрусталика.............................................11
1.2. Белки хрусталика - кристаллины...........................................13
1.3. Низкомолекулярные соединения в хрусталике................................15
1.3.1. Антиоксиданты в хрусталике: глутатион и аскорбат....................15
1.3.2. Триптофан и его метаболиты..........................................16
1.3.3. Хрусталик и ультрафиолетовое (УФ) излучение.........................20
1.3.4. Функции УФ-фильтров.................................................21
1.4. Кинуренины: фотохимические реакции.......................................22
1.4.1. Фогостабилыюсть кинурснина и его производных........................22
1.4.2. Фотолиз кипуренина..................................................24
1.4.3. Тушение тринлетного состояния кипуренина............................26
1.5. Кинуренины: термические реакции..........................................29
1.5.1. Дезаминирование и дскарбоксилироваиис...............................29
1.5.2. Циклизация..........................................................31
1.5.3. Автоокисление ЗОНКХ.................................................32
1.5.4. Присоединение к аминокислотным остаткам белков......................33
1.6. Катаракта у подопытных животных..........................................37
1.7. Постановка задачи........................................................39
Глава II. Экспериментальная часть.................................................41
2.1. Материалы и реактивы.....................................................41
2.2. Синтезы..................................................................41
2.2.1. Синтез дезаминированного кинуренина (СКА)......................... 41
2.2.2. Синтез адцуюгов кинуренина с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом................................................................42
2.3. Инкубирование............................................................42
2.3.1. Образование аддуктов................................................42
2.3.2. Разложение аддуктов.................................................43
2.3.3. Разложение КЫ и ЗОНКЫ...............................................43
2.4. Выделение небелковых экстрактов из хрусталиков...........................43
2
2.5. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)........................44
2.6. Кинетическая оптическая спектроскопия....................................45
2.7. Определение концентрации белка в растворе с использованием метода Бредфорда.................................................................45
2.8. Определение концентрации свободных тиолов с использованием реактива Эллмана................................................................. 46
2.9. Масс-спектрометрия.......................................................47
2.10. Статистическая обработка результатов....................................48
Глава III. Дезаминированный кинурсиин и его реакции с биологическими молекулами. Стабильность аддуктов.................................................49
3.1. Введение.................................................................49
3.2. рН-зависимость реакции разложения КЫ и ЗОНЮЧ.............................49
3.3. Механизм дезаминирования.................................................53
3.4. Выделение продуктов термолиза КЫ.........................................57
3.5. Определение констант скорости реакций СКА с аминокислотами и антиоксидантами...........................................................58
3.6. Кинетическая оптическая спектроскопия. Определение констант скорости взаимодействия СКА с глутатионом (ОБН) и цистеином (Сув)..................63
3.7. Разложение аддуктов КМ-Ьуэ, КМ-Шб, КЫ-СуБ, КЫ-ОБН........................67
3.8. Анализ кинетических зависимостей.........................................71
3.9. Заключение...............................................................72
Глава IV. Фотофизические свойства кину реки на, связанного с биологическими молекулами........................................................................74
4.1. Введение.................................................................74
4.2. Синтез аддуктов КИ с аминокислотами и антиоксидантом глутатионом.........74
4.3. Модифицирование модельного белка лизоцима молекулами кинуренина..........75
4.4. Масс-спектры исходного (НЕ\¥Ь) и модифицированного (тНЕ\УЬ) лизоцима....76
4.5. Анализ спектров оптического поглощения и масс-спектров НЕ\УЬ и шНЕ\\Т-....77
4.6. Фотохимия и фотофизика кинуренинов.......................................81
4.6.1. Оптическая спектроскопия аддуктов....................................81
4.6.2. Ультрабыстрая динамика возбужденных состояний КЫ-ЬуБ, КЫ-СуБ,
К*1-Н5б и К>!-СБН...........................................................83
4.6.3. Фотофизические свойства аддуктов КК-ЬуБ, КМ-СуБ, КК-1Пб, КМ-вБН 86
3
4.6.4. Ультрабыстрая динамика возбужденного состояния тНЕ\УЬ..............87
4.6.5. Лазерный импульсный фотолиз шНЕ\УЬ.................................88
4.6.6. Фотофизические и фотохимические свойства лизоцима, модифицированного кинурснином...............................................................91
4.7. Заключение..............................................................93
Глава V. Триптофан и кинуренин в хрусталиках экспериментальных животных....94
5.1. Введение................................................................94
5.2. Небелковые экстракты из хрусталиков крыс................................94
5.3. Уровень триптофана (Тгр) в хрусталиках крыс линий Вистар и ОХУ8.........95
5.4. Уровень кинуренина (КЫ) в хрусталиках крыс линий Вистар и ОХУБ..........97
5.5. Возрастная зависимость уровня Тгр и КЫ в хрусталиках крыс линий Вистар
и ОХУБ.......................................................................98
5.6. Заключение.............................................................100
Выводы..........................................................................101
Список литерату ры..............................................................102
Приложение 1....................................................................118
4
Список используемых сокращений
АФК - активные формы кислорода
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ВКСФ - времякоррслированный счет фотонов
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФ - диметилформамид
кДа - кило Дальтон
ЛИФ-лазерный импульсный фотолиз
НАД - никотинамидадениндинуклсотид
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
УФ - ультрафиолетовый
3ÜHCKAG - O-ß-D-гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутеновая кислота ЗОНКО - O-ß-D-гликозид 3-гидроксикинуренина
30HKG-GSH - глутатионовый аддукт O-ß-D-гликозида 3-гидроксикинурснина 30HKN - 3-гидроксикинурснин '
301IKN yellow - 2-карбокси-8-гидрокси-4-оксо-1,2,3,4-тетрагидрохинолин ACN - ацетонитрил
АНА - 4-(2-аминофенил)-4-оксобутановая кислота
AHBG - Ö-ß-D-гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутановая кислота Asc Ас - аскорбиновая кислота
СКА - 4-(2-аминофенил)-4-оксокротоновая (оксобугсновая) кислота
Cys - цисте и н
DTT - дитиотрситол
GSH- глутатион восстановленный
GSSG - глутатион окисленный
HEWL - куриный лизоцим
His - гистидин
HQN — гидроксихинолин
IAA - йодацетамид
IDO - индолами-2,3-диоксигсназа
KN - кину ренин
KN yellow - 2-карбокси-4-оксо-1,2,3,4-теграгидрохинолин KN-Cys - аддукт кинуренина с цистеином KN-GSH - аддукт кинуренина с глутатионом
KN-His - алдукт кинуренина с гистидином KN-Lys - аддукт кинуренина с лизином Met - метионин
mHEWL-куриный лизоцим, модифицированный молекулами кинуренина
MS/MS спектр - тандемный масс-спектр
/V-ас- - Д-ацетилирование
NFK - Л'-формилкинурснин
г-Вос - А’-трст-бутоксикарбонилирование
Тф-триптофан
Туг-тирозин
XAN - ксантуреновая кислота
6
Введение
В настоящее время потеря остроты зрения является одной из значимых проблем для населения земного шара. Наиболее распространенными заболеваниями глаза являются возрастная катаракта, глаукома и макулодистрофия сетчатки [1]. Несмотря на большой прогресс в разработке новых методов профилактики потери зрения за последнее десятилетие, эти заболевания остаются основными причинами слепоты в мире. В зоне риска находятся, в основном, пожилые люди, однако, как показывает статистика, с каждым годом увеличивается число молодых людей, страдающих от потери зрения [2]. Ранее считалось, что снижение остроты зрения - эго исключительно возрастной процесс, который начинает проявляться в среднем возрасте и прогрессирует в ходе старения организма. Дополнительные факторы, такие как диабет, курение, облучение ультрафиолетом (УФ) могут значительно ускорить разрушительные процессы в глазу человека, а также повлиять на состояние организма в целом. При попадании УФ-излучения в ткани хрусталика может происходить их повреждение по различным фотохимическим механизмам. Процесс развития катаракты связан с постепенным помутнением хрусталика, что приводит к снижению остроты зрения. На сегодняшний день основными способами лечения слепоты являются оперативная замена хрусталика на искусственный, либо нормализация глазного давления при глаукоме. Ежегодно в мире проводятся миллионы операций по улучшению зрения, но, как известно, оперативное вмешательство способно как улучшить состояние зрения, так и привести к полной его потере. В настоящее время не существует лекарства, способного полностью предотвратить образование катаракты, поэтому исследование возрастных и катарактальных изменений в составе хрусталиков является актуальной задачей, и результаты, полученные в ходе таких исследований, могут являться значительным этапом в разработке методов лечения и профилактики катаракты.
Помутнение хрусталика возникает в результате повреждения белков, составляющих хрусталик: теряется его прозрачность, образуются нерастворимые агрегаты, на которых происходит рассеивание световых лучей; при этом изображение дефокусируется. Сам хрусталик представляет собой прозрачное тело и выполняет функцию биологической линзы. Прозрачность хрусталика обусловлена отсутствием органелл в волокнистых клетках (волокнах) хрусталика. Хрусталик на 30-40 % состоит из белков [3-7], а основную массу хрусталика составляет вода. Хрусталик млекопитающих увеличивается в размерах за счет образования новых слоев ткани вокруг первоначально сформированного ядра.
7
В человеческих хрусталиках присутствует группа соединений с низким молекулярным весом, поглощающих большую часть УФ-облучения в диапазоне от 300 нм до 400 нм [8-11]. Эти соединения - к и ну ренин (КЫ), 3-гидроксикинуренин (ЗОНКЫ), О-р-Э-гликозид З-гидроксикинуренина (ЗОНКХЗ) и гликозид 4-(2-амино-3-гидроксифенил)-4-оксобутановой кислоты (АНВС) - являются метаболическими продуктами аминокислоты триптофан. В человеческом хрусталике они выполняют функцию УФ-фильтров, защищая хрусталик и сетчатку от фотоиндуцированных повреждений, а также повышая зоркость за счет снижения хроматических аберраций. Предполагается, что ковалентное присоединение таких соединений к белкам хрусталика может приводить к окрашиванию белков, возникновению перекрестных связей и, в конечном итог е, к развитию катаракты. При развитой катаракте наблюдается заметное окрашивание - хрусталики становятся оранжевыми или коричневыми [12,13]. Существует предположение, что ковалентное присоединение кинурснинов к белкам может происходить по различным механизмам.
В течение долгого ^ремени кинуренины считались фотохимически инертными соединениями. Единственным исключением были фотохимические реакции /У-формилкинуренина [14,15]. Было показано, что при фотолизе этого соединения образуется триплетная возбужденная молекула, способная реагировать непосредственно с субстратом. Кроме того, Л^формилкинурении под УФ-излучением способствует образованию высокореакционного синглетного кислорода [10]. Флетчер с соавторами [16,17] излучали влияние свободных радикалов па процесс старения организма на примере старения хрусталика. Ныло показано, что окисление тканей хрусталика активными формами кислорода (АФК) может вести к развитию возрастной (сенильной) катаракты. Фотовозбуждение других кинуренинов приводит к образованию синглетного возбужденного состояния, которое релаксирует в основное в пикосекундном временном диапазоне [9]. На основе этих наблюдений были сделаны выводы, что в хрусталиках млекопитающих кинуренины не являются фотосснсибилизаторами, и поглощаемая световая--энергия расходуется в процессах, не приводящих к повреждению ткани. Однако в последствии было обнаружено, что в водных растворах кинуренина под действием УФ-облучения с квантовым выходом порядка 2 % образуется короткоживущий интермедиат -триплетное возбужденное состояние [18]. Присутствующие в хрусталике глаза
аминокислоты и антиоксиданты могут взаимодействовать с ТК1Ч'. Такие фотохимические реакции могут приводить как к модифицированию белков хрусталика, так и к изменению нормальной функции УФ-фильтров [19,20]. Важно отметить, что в этом случае аминокислоты могут являться потенциальными мишенями для фотоокисления.
8
Другим возможным каналом модифицирования белков хрусталика является термическое разложение кинуренинов. Ранее было показано, что кинуренины способны претерпевать реакцию спонтанного дезаминирования с образованием ненасыщенных соединений, обладающих высокой реакционной способность [21,22]. В результате последующих реакций может произойти ковалентное присоединение таких молекул к белкам хрусталика, что приводит к необратимым изменениям в тканях, и может явиться причиной образования катаракты. В настоящее время в литературе представлено недостаточное количество данных для детального описания механизмов таких реакций. Стоит отметить, что большинство исследований заболеваний органов зрения проводится в медицинских учреждениях, а результаты носят, прежде всего, качественный характер. Создание моделей, максимально приближенно описывающих процессы, которые могут происходить при развитии катаракты, позволит разработать новые методы ингибирования вредоносных реакций в тканях хрусталика. Таким образом, исследования термических реакций с участием дезаминированных кинуренинов в хрусталике глаза являются актуальной задачей на сегодняшний день. Сравнение уровня УФ-фильтров в хрусталиках с различной степенью катаракты позволит определил, связь этих соединений с развитием патологии. Результаты таких исследований могут внести вклад в понимание процессов, происходящих в хрусталике с возрастом, а также в ходе развития катаракты.
Настоящая работа посвящена исследованию реакций дезаминированного кинуренина с биологически важными молекулами при физиологических условиях, установлению уровня УФ-фильтров в хрусталиках подопытных животных. Исследования были проведены с использованием метода ВЭЖХ, кинетической оптической спектроскопии, а также масс-спсктромстрическими методами.
Целями данной работы является:
1) Разработка методик синтеза и выделения дезаминированного кинуренина и его аддуктов с аминокислотами и антиоксидантами, входящими в состав хрусталика; анализ стабильности синтезированных аддуктов;
2) установление детального механизма дезаминирования кинуренинов при различных значениях pH среды;
3) разработка методики модифицирования модельного белка молекулами кинуренина, определение положения модифицирования, анализ фотофизических свойств кинуренина, присоединенного к аминокислотам и модельному белку;
9
4) развитие физико-химических методов для определения уровня триптофана и его метаболита кинуренина в хрусталиках экспериментальных животных в зависимости от возраста и степени развития катаракты.
Настоящая диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы.
В первой главе диссертации приведен обзор литературы по свойствам кинуренинов -УФ-фильтров хрусталика, их взаимодействию с биологически важными молекулами, фотохимическим реакциям кинуренина и его производных, описан состав хрусталика, а также функции низкомолекулярных соединений - кинуренинов и антиоксидантов в хрусталике.
Во второй главе представлены методики синтеза соединений, методики проведения экспериментов методами ГЗЭЖХ, кинетической оптической спектроскопии, масс-спектрометрии.
Третья глава посвящена исследованию реакции дезаминирования кинуренинов в зависимости от кислотности среды и установлению детального механизма дезаминирования кинуренинов; описаны реакции дезаминированного кинуренина с аминокислотами и антиоксидантами, присутствующими в хрусталике глаза; установлена стабильность аддуктов дезаминированного кинуренина с аминокислотами и антиокс идантам и.
В четвертой главе описана методика модифицирования модельного белка УФ-фильтром кинуренином и анализа фотофизических свойств кинуренина, связанного с различными молекулами.
Пятая глава посвящена исследованию уровня УФ-фильтров в хрусталиках экспериментальных животных.
ю
- Київ+380960830922