Оглавление
Введение...................................................................4
Глава 1 Обзор литературы..................................................10
1.1 Традиционные методы анализа кривых малоуглового рассеяния...........10
1.2 Ab initio определение формы частиц..................................14
1.3 Расчет кривых малоуглового рассеяния от известных атомных структур. 17
1.4 Метод молекулярной тектоники. Рассеяние гетсро- и гомодимерами 20
Глава 2 Использование ограничений на симметрию и анизомстрию частицы при ab initio определении формы программой DAMMIN.............................24
2.1 Учет симметрии и анизометрии в программе DAMMIN.....................24
2.2 Примеры использования симметрии и анизометрии при ab initio определении формы....................................................25
2.2.1 Восстановление формы димера пируват декарбоксилазы из пивных дрожжей............................................................25
2.2.2 Восстановление формы тетрамера пируват оксидазы из Lactobacillus plant arum.........................................................25
2.2.3 Восстановление формы VI ЛТФазы из Manduca sexta.................25
Глава 3 Ab initio определение доменной структуры белков по данным рассеяния растворами................................................................25
3.1 Ограничения ab initio определения формы.............................25
3.2 Модель свободных виртуальных аминокислотных остатков с ограничениями на локальную цеиочечноегь..............................25
3.3 Алгоритм минимизации................................................25
3.4 Примеры применения техники виртуальных остатков.....................25
3.4.1 Исследование структуры лизоцима из куриного яичного белка......25
3.4.2 Исследование альбумина сыворотки крови..........................25
3.4.3 Исследование гексокиназы из дрожжей.............................25
3.4.4 Исследование пируват декарбоксилазы из пивных дрожжей..........25
3.4.5 Исследование структуры хитин-связываюшего белка из Streptomyces 25
3.5 Обсуждение полученных результатов...................................25
Глава 4 Добавление недостающих петель и доменов к известным моделям белков с использованием рентгеновского рассеяния растворами...............25
4.1 Датьнейшее развитие метода виртуальных остатков.....................25
4.2 Типы используемых моделей...........................................25
2
4.2.1 Модель свободных виртуальных остатков..........................25
4.2.2 Модель виртуальных остатков с упругими силами между соседями... 25
4.2.3 Модель индивидуальных остатков с упругими силами между соседями..........................................................25
4.2.4 Свертывание сочлененной цепи состоящей из индивидуальных остатков..........................................................25
4.3 Проверка и применение развитых подходов............................25
4.3.1 Проверка предложенных мегодов на тестовых примерах.............25
4.3.2 Конформапионная подвижность небольших петель/доменов...........25
4.3.3 Исследование глутатион S-трансферазы и слитых белков...........25
4.4 Обсуждение полученных результатов..................................25
Г'лава 5 Исследование четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники.............................................................25
5.1 Разработка программного пакета MASSHA, предназначенного для моделирования атомных структур и определения их формы по данным малоуглового рассеяния.................................................25
5.1.1 Трехмерная графика.............................................25
5.1.2 Моделирование гетеродимерной структуры.........................25
5.1.3 Моделирование гомодимерной структуры...........................25
5.1.4 Основные преимущества программного пакета MASSHA...............25
5.2 Анализ отличий четвертичной структуры тиаминдифосфат-зависимых ферментов в кристалле и растворе....................................25
5.2.1 Экспериментальные данные.......................................25
5.2.2 Исследование пируваг декарбоксилазы из Zymomonas mobilis.......25
5.2.3 Исследование пируват оксидазы из Lactobacillus plantarum.......25
5.2.4 Исследование транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae.........25
5.2.5 Исследование нативной пируваг декарбоксилазы из пивных дрожжей...........................................................25
5.2.6 Исследование пируваг декарбоксилазы из пивных дрожжей в активированном состоянии..........................................25
5.2.7 Обсуждение полученных результатов..............................25
Заключение...............................................................25
Библиография.............................................................25
Введение
История современной физической науки показывает, что рентгеновское излучение является эффективным средством для физической, химической, биологической и структурной характеризации вещества. Например, рентгеновская флуоресценция широко используется для качественного и количественного анализа вещества, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия может использоваться для изучения электронной структуры вещества. Рентгеновская кристаллография позволяет определять трехмерные структуры на атомном разрешении, а различные методики рентгеновского рассеяния дают структурную информацию для аморфных материалов с разной степенью разрешения.
Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУР), представляющее собой центральную часть дифракционной картины, также позволяет исследовать вещества самой разнообразной структуры, в которых характерные размеры неоднородностей лежат в диапазоне 1*103 нм. Чем больше размер рассеивающего объекта, тем в меньшем угловом интервале сосредоточено рассеянное излучение, и рассеяние на малые углы (меньше нескольких градусов) несет информацию о ’’крупномасштабном” (но отношению к длине волны излучения X.) рассеивающем ансамбле. В структурном анализе вещества с помощью рентгеновского и нейтронного рассеяния X ~ 0.1-ь1 нм, что по порядку-величины совпадает с межатомными расстояниями. Таким образом, МУР дает информацию о надатомной структуре вещества.
Метод малоуглового рассеяния применяется к следующим классам объектов: биологически активные соединения. С помощью малоуглового рассеяния изучается строение биологических макромолекул и их комплексов (белков, нуклеиновых кислот, вирусов, мембран и др.) При этом удается исследовать строение частиц в водно-солевых растворах, то есть в условиях, приближенных к условиям их функционирования.
Жидкости, полидисперсные коллоидные системы и аморфные тела. Применение малоуглового рассеяния дает возможность анализа термодинамических характеристик и кластерной структуры жидкостей, флуктуации плотности и разделения фаз в стеклах и других аморфных телах.
4
Полимерные соединения. Малоугловым рассеянием исследуются особенности укладки и общие характеристики натуральных и синтетических полимеров, как в растворах, так и в твердом состоянии.
Поликристаллические и пористые вещества, сплавы, порошки. Малоугловос рассеяние позволяет исследовать различные характеристики дисперсной структуры твердых тел - пределы растворимости в твердых растворах, размеры зерен в порошках, пор в пористых веществах, кристаллитов в поликристаллах, дефекты в металлах.
Использование синхротрошшх источников рентгеновского излучения значительно расширило применение малоуглового рассеяния в структурных исследованиях. Преимущество синхротронного излучения (СИ) по сравнению с излучением рентгеновских трубок определяется значительно более высокой интенсивностью непрерывного рентгеновского спектра и отсутствием в СИ характеристических линий, которые затрудняют вариацию длин волн (например, при исследовании рентгеновских спектров поглощения и рассеяния с использованием рентгеновских трубок). Излучение в рентгеновских трубках происходит при резком торможении электронов, летящих со скоростью порядка 10'1 м/с, в тонком слое металла, и при этом практически вся энергия электронов превращается в тепло, что и ограничивает мощность рентгеновского пучка. В случае синхротронного ускорителя коротковолновое электромагнитное излучение возникает при движении электрона с ускорением при релятивистских скоростях. Эффективность СИ вызвана сочетанием следующих важнейших для структурных приложений свойств:
очень высокая интенсивность рентгеновского излучения очень широкий спектральный интервал малая угловая расходимость малый размер фокуса высокая степень поляризации периодическое прерывание пучка во времени Каждое из этих свойств и комбинация ряда из них позволили ставить исследования фундаментального и прикладного плана, немыслимые до применения синхротронного излучения. Для матоуглового рассеяния пока используется главным образом высокая интенсивность пучка, его малая угловая расходимость, широкий спектральный интервап. Область длин волн в
5
синхротронных источниках охватывает интервал от жесткого рентгеновского излучения до диапазона вакуумного ультрафиолетового излучения.
Одной из наиболее перспективных областей применения малоуглового рассеяния (МУР) рентгеновского синхротрошюго излучения является изучение нативных биополимеров в растворе. Особое развитие в последние десятилетия получила методика исследования с помощью МУР белковых макромолекул. Актуальность таких исследований обусловлена тем обстоятельством, что строение макромолекул и структурный механизм их функционирования определяется в условиях, максимально приближенных к физиологическим, тогда как белковая кристаллография применима лишь к кристаллическим объектам, а методы электронной микроскопии и электронной дифракции требуют специальной обработки образцов, что может приводить к неконтролируемому изменению структуры. Кроме того, МУР позволяет исследовать структурные перестройки, вызванные изменением условий эксперимента. Несмотря на успехи в развитии экспериментальной аппаратной составляющей метода МУР остается много нерешенных проблем с вычислительно-интерпретационной стороной исследований. Таким образом, исследование структуры биологических макромолекул методом МУР, использующим синхротронпос излучение и развитие новых методов моделирования является весьма актуальной задачей.
В настоящей диссертационной работе представлены новые методы анализа структуры белка по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием синхротронного излучения и результаты их применения для анализа третичной и четвертичной структуры белков в широком диапазоне молекулярных масс и принадлежащих различным семействам, что позволило наиболее полно оценить значимость развитых алгоритмов.
Первая глава посвящена обзору литературы по теме матоуглового рассеяния и его применения к анализу структуры биологических объектов. Рассмотрены общие методики и конкретные алгоритмы, используемые в данной диссертационной работе, а также подходы, которые были модифицированы и усовершенствованы в рамках настоящего исследования.
Во второй главе описан метод ab initio определения формы белков по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с использованием модели конечных объемных элементов. Показана необходимость учета дополнительной
6
информации, о симметрии и/или анизометрии частицы, для получения более достоверных результатов анализа трехмерной структуры низкого разрешения. Приведены примеры определения формы нескольких белков без и с включением дополнительной информации. На основе полученных результатов сделан вывод о том, что использование симметрийных ограничений и анизометрии позволяет снизить количество независимых параметров, описывающих модель на данном уровне разрешения, и, в конечном счете, уменьшить неоднозначность восстановления формы. Немаловажным здесь также является ускорение вычислений, что приводит к существенному уменьшению времени расчета моделей.
В третьей главе представлен новый метод, разработанный для ab initio определения доменной структуры белков. Для этой цели предложена модель свободных виртуальных аминокислотных остатков, соответствующая более высокому разрешению, нежели в случае восстановления формы. Таким образом, для нахождения искомой модели используется более широкий диапазон экспериментальных данных рассеяния; кроме того, в алг оритм поиска включено требование выполнения условия локальной цепочечности модели. В данном методе также предусмотрена возможность учета симметрии. Эффективность предложенных методов проиллюстрирована на тестовых примерах для белков с известной структурой в кристалле и на примерах построения моделей белков с неизвестной кристаллической структурой но экспериментальным данным рассеяния растворами, полученным с использованием рентгеновского синхротронного излучения.
Четвертая глава посвящена дальнейшему развитию метода определения доменной структуры белка для дополнения структур высокого разрешения, полученных другими методами, например, с помошью белковой кристаллографии или ядерного магнитного резонанса (ЯМР), у которых не определен фрагмент полипептидиой цепи или же не известна структура целого домена. Для данной цели модель аминокислотных остатков может быть дополнена информацией о первичной последовательности белка и наборе элементов вторичной структуры (а-спирати и (3-листы), а также наложен ряд ограничений связанных с особенностями свертывания полипептидиой цепи. Возможности данной методики продемонстрированы как на тестовых моделях, так и на применении к реальным белкам для определения конформации
7
линкеров, подвижных периферийных участков цепи и структуры доменов в слитых белках.
Расширение возможностей описания структуры белка, которое достигается при исследовании дополняющими друг друга методами высокого и низкого разрешения: белковой кристаллографии, ЯМР и малоуглового рассеяния показано в пятой главе. Представлен метод молекулярной тектоники, позволяющий моделировать четвертичную структуру многочастичных белков в растворе с использованием известных структур высокого разрешения их субъединиц. Здесь же описаны свойства и возможности разработанного автором нового программного пакета MASSHA (аббревиатура от английского Manipulation of Atomic Structures and SHape Analysis), предназначенного для моделирования трехмерных макромолекулярных структур по данным малоуглового рассеяния, и описаны результаты исследований данным методом тиаминдифосфат-зависимых белков, давшие ценную информацию о четвертичной структуре исследуемых белков в растворе и характера различий кристалл-раствор.
Таким образом, в настоящей диссертационной работе решаются следующие задачи:
1. Учет симметрии и анизометрии при восстановлении формы частиц по данным малоуглового рентгеновского рассеяния с применением метода конечных объемных элементов.
2. Разработка нового подхода к ab initio определению доменной структуры белков в растворе, основанного на представлении белковой модели как совокупности виртуальных аминокислотных остатков.
3. Разработка методов уточнения и дополнения моделей белков высокого и низкого разрешения путем определения конформации их подвижных фрагментов и доменной структуры недостающих субъединиц.
4. Разработка программного пакета для уточнения четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники, предусматривающего возможность как интерактивного, так и автоматического моделирования.
5. Исследование с помощью предложенных методов широкого спектра белков как с известной (тиаминдифосфат-зависимые ферменты, лизоцим, альбумин, гексокиназа и др.), гак и неизвестной или частично известной (VI АТФаза, хитин-связывающий белок С11В1, S-трансфераза и др.) структурой в кристалле.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Учет априорной информации о симметрии и анизометрии частицы позволяет получать более достоверные результаты при анализе трехмерной структуры низкого разрешения.
2. Развит новый подход к моделированию экспериментальной интенсивности в области средних углов с помощью техники виртуальных остатков, позволяющий восстанавливать ob initio доменную структуру белков в растворе с разрешением до 1 нм.
3. Развиты методы определения конформации неизвестных фрагментов (в частности, подвижных периферийных участков цепи и структуры доменов в слитых белках) в неполных моделях белков высокого и низкого разрешения.
4. Разработано программное обеспечение для анализа данных рассеяния рентгеновского синхротронного излучения растворами белков, реализующего предложенные методы.
5. Разработан программный пакет MASSHA для уточнения четвертичной структуры белков методом молекулярной тектоники, обеспечивающего улучшенные возможности для комбинирования интерактивного и автоматического моделирования, а также учета симметрии второго порядка, для Wintel платформы.
6. Применение предложенных методов позволило получить ценную структурную информацию о строении ряда белковых макромолекул в растворе.
9
- Київ+380960830922