- 2 -ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
Список обозначений и сокращений ................................. 6
ВВЕДЕНИЕ......................................................... 7
Глава I. СДВИГИ ЯМР И ИХ ФИЗИЧЕСКАЯ ПРИРОДА................... 12
1.1. Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования ............ 12
1.2. Химический сдвиг ....................................... 14
1.3. Межспиновое взаимодействие и сдвиг ..................... 17
1.4. Диполярный сдвиг ...................................... 19
1.5. Контактный сдвиг ...................................... 21
1.6. Контактные и псевдоконтактные сдвиги в структурных исследованиях. Шифт-зовды............................... 22
1.7. Сдвиги при образовании водородной связи ............... 24
1.8. Сдвиги ЯМР и химический обмен ......................... 27
Глава П. ПРЯМЫЕ И КОСВЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР И ПРОБЛБМА ТОЧНОСТИ ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ 32
2.1. Диапазоны сдвигов и ширина линий при прямом изучении малых молекул .......................................... 32
2.2. Внедрение ЯМР в молекулярную биологию. Принципиальные ограничения метода ЯМР при непосредственном изучении спектров макромолекул ............................ 38
2.3. Двумерная фурье-спектроскопия ЯМР....................... 41
2.4. Непрямые исследования с помощью молекул-зондов ......... 44
2.5. Измерение статической магнитной восприимчивости веществ в растворе. Метод Эванса ......................... 48
2.6. Метод детектирующих зондов ЯМР. Уравнения Соломона-Бломбергена............................................. 52
2.7. Неспецифические и специфические молекулярные зонды.
- з -
Краткий обзор........................................ 55
2.8. Оценка сдвигов ЯМР при работе по методу молекул-сви-детелей и молекул-зондов. Проблема точности измерений ......................................................... 62
Глава Ш. ВОЗМОЖНОСТЬ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ ... 66
3.1. Разрешающая способность и стабильность резонансных условий ............................................... 66
3.2. Существуют ли разработанные методы прецизионных измерений сдвигов ЯМР? Многочастотный резонанс в спин-связанных системах и метод биений в спиновых генераторах ................................................. 69
3.3. Неприменимость приемов обзорной спектроскопии для точного измерения сдвигов ............................. 71
3.4. Влияние формы линии на измерение сдвига ................ 73
3.5. Влияние фазового утла детектирования на измерение сдвига ................................................ 80
3.6. Влияние частичного перекрывания линий на измерение сдвигов................................................ 84
3.7. Влияние температуры образца. Требуемая термостабильность и возможности газовых термостатов ............... 88
Глава 17. ЭКСПЕРИГШТМЪНАЯ УСТАНОВКА И МЕТОДИКА ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ................................... 94
4.1. Свип-спектрометр с модуляцией поля на звуковой частоте в качестве базы экспериментальной установки .. 94
4.2. Следящая система на основе развертывающего модуляционного генератора................................... 97
4.3. Термостабилизация образца по сигналу ЯМР лабильных притонов ............................................. 100
- 4 -
4.4. Стабильность формы линии в случае коаксиального образца. Устройство для автоматического квадратурного шиммирования поля ................................ 104
4.5. Функциональная схема установки для прецизионного измерения сдвигов ЯМР ................................. 108
4.6. Измерения с "внутренним термометром" .................. 112
4.7. Измерение ширины линии с помощью калиброванного вращения фазы ......................................... 115
Глава У. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ И МОДЕЛЬНЫЕ ОПЫТЫ .................. 118
5.1. Часовая стабильность отсчета резонансной частоты (коаксиальный образец) ................................ 118
5.2. Влияние сборки и разборки коаксиального образца на измерение сдвигов ..................................... 119
5.3. Калибровка по раствору парамагнитной соли ............. 121
5.4. Кинетика восстановления растворенного кислорода системой дыхательных коферментов ...................... 122
5.5. Температурная зависимость относительных химсдвигов и константы спин-спинового взаимодействия в молекуле этанола............................................. 126
5.6. Контактные сдвиги протонов воды в присутствии спиновой метки ........................................... 128
Глава 71. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕЦИЗИОННОГО ИЗМЕРЕНИЯ СДВИГОВ
В БИОФИЗИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ..................... 131
6.1. Тиолат-анионные комплексы железа и марганца 131
6.2. "Пурпурный комплекс" окедцазы д-аминокислот и его диамагнетизм .......................................... 141
6.3. Связывание ионов марганца молекулой тРНК .............. 142
6.4. Изучение конформационных состояний предшественников
- 5 -
спиновых меток........................................... 147
6.5. Изучение физико-химических свойств и топографии активного центра растительной пероксидазы ...................... 157
ВЫВОДЫ......................................................... 177
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................. 180
- 6 -
СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ
- константа магнитного экранирования.
5 - электронный спин.
5 - константа Сведберга (приведённая скорость седиментации).
£ - фактор Ланде.
а - условный фактор Ланде, соответствующий наблюдаемой линии оэфф.
ЭПР.
$(*)- форм-функция линии ЯМР, задаваемая конфигурацией магнитного поля.
7**,7г - продольное и поперечное времена релаксации ЯМР (ЭПР).
Ъ - химический сдвиг.
^ времена корреляции микрофлуктуаций магнитного поля..
^ - характеристическое время вращательной диффузии.
)М- релаксационная ширина резонансной линии, V/ = -у=~ , Часто V/ - полная ширина резонансной линии. 2
измеряемый магнитный момент.
Р - резонансная частота, отнесённая к ширине форм-функции.
А - длина волны.
А - релаксационная ширина, отнесённая к ширине форм-функции.
ПМР - протонный магнитный резонанс (ЯМР *Н).
ПМЦ - парамагнитный центр (парамагнитный ион, свободный радикал). СГБП - спиновый генератор боковой полосы.
М.д. - миллионные доли резонансной частоты ЯМР (единица измерения сдвига ЯМР).
ВДО - молекула воды, содержащая один дейтрон.
ДМСО - диметилсульфоксид.
НАД - никотинамидадениндинуклеотид, кофермент дыхательной цепи. ФМН - флавинмононуклеотид, кофермент дыхательной цепи.
- 7 -
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. В настоящее время методы радиоспектроскопии находят все более широкое применение в биофизических и биохимических исследованиях. Особенно бурно развивается метод ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Успехи ЯМР опираются на три технических достижения: создание высокопольных сверхпроводящих магнитов-соленоидов с высокой однородностью поля и связанное с этим резкое повышение рабочих частот спектрометров; развитие идей и методов импульсной спектроскопии ЯМР с разделением времен возмущения-прослушивания спиновой системы и фурье-анализом сигналов ЯМР; наконец, широкое внедрение ЭБМ в управление экспериментом. Обусловленный указанными факторами рост чувствительности, разрешающей способности и информативности метода ЯМР позволяет применять его для изучения структуры биомакромолекул малых (до ~ 10000 Дальт.) и, в отдельных случаях, средних (до ~50000 Дальт.) молекулярных весов в растворе. Поэтому ЯМР высокого разрешения притягателен для биофизиков, несмотря на то, что в отношении детальности информации метод рентгеноструктурного анализа молекул в кристаллическом состоянии - вне конкуренции. Само по себе развитие ЯМР в значительной степени стимулируется именно требованиями современной молекулярной биофизики, на что постоянно указывается в рекламной периодике ведущих радиоспектроскопических фирм.
Появление данной работы в определенной степени связано с этой тенденцией. Работа посвящена созданию способа повышения точности измерения сдвигов ЯМР и демонстрации новых возможностей в области биофизического эксперимента, появляющихся в связи с существенным увеличением точности измерения сдвига изоли-
- 8 -
рованной линии ЯМР.
В спектроскопии ЯМР высокого разрешения значительную часть информации о структуре молекул получают именно из значений сдвига линий ЯМР, под которым, в общем, понимают положение линии на частотной абсциссе спектра относительно эталонной линии. Сдвиг обусловлен тремя основными причинами: диамагнитной экранировкой ядер электронами; сверхтонким диполярным и фермиевским взаимодействием ядер с неспаренными электронами парамагнитных центров; эффектами объемного макроскопического диамагнитного экранирования, связанного с геометрией образцов (составных, например, коаксиальных). Информация, извлекаемая из значений сдвига, может касаться типа химического окружения данного ядра, характера взаимодействия молекул, расстояния ядра от парамагнитного центра, скорости химического обмена и типа координации в комплексных соединениях, магнитных свойств исследуемых молекул и т.д. Указав (и обосновав причины), что границей точности измерения сдвигов обычно считают разрешающую способность спектрометра, мы в данной работе определили понятие прецизионного измерения сдвигов как измерение с точностью, существенно превосходящей разрешающую способность спектрометра (гл. I).
Научная новизна пезультатов. Определены области применения ЯМР, в которых прецизионное измерение сдвигов способно предоставить новую информацию. Это, во-первых, измерение слабых вариаций химсдвигов ЯМР малых молекул, вызываемых заторможенными конформационными переходами, термическим возбуждением экранирующих электронов и вандерваальсовыми взаимодействиями, а также особо точное измерение частот ЯМР в специальных физических экспериментах. Далее, прецизионное измерение сдвигов
- 9 -
может оказаться полезным в методе низкомолекулярных детектирующих зондов ЯМР. Согласно этому методу, свойства и структура макромолекул исследуются косвенно, с помощью изучения ЯМР малых молекул, вступающих с макромолекулой во взаимодействие.
При этом отсутствуют проблемы концентрационной чувствительности и анализа спектров, существенные при прямом исследовании макромолекул. Метод зоццов применим в случаях, когда прямые наблюдения в принципе невозможны, т.е. при исследовании крупных (более 40000 Дальт.) макромолекул в относительно низкой (менее Ю-4 М) концентрации. Однако при этом измеряемые эффекты (в частности, изменения сдвигов) уменьшаются в отношении, равном отношению концентраций молекулы-объекта и молекулы-зонда. Интересной областью приложения метода прецизионных измерений сдвигов ЯМР может явиться исследование магнитных свойств молекул с помощью измерения статической магнитной восприимчивости веществ в растворе. В двух последних случаях именно прецизионные измерения позволят получить ценную геометрическую и физическую информацию о макромолекулах, поскольку ожидаемые эффекты при умеренных концентрациях макромолекул ( ^ ТО-4 М) зачастую вблизи или ниже уровня разрешающей способности спектрометров (гл. П).
В современной литературе отсутствуют указания на существование разработанного метода прецизионных измерений сдвигов ЯМР. В гл. Ш приводится анализ причин этого, а также тех трудностей, которые следует преодолеть при создании такого метода. Выделяются три подчиненные задачи: во-первых, создать устройство, позволяющее автоматически регистрировать и накапливать значения сдвига данного сигнала. Во-вторых, необходимо стаби-
- 10 -
лизировать температуру образца с точностью, лучшей, чем 0,1 °С. Эта задача осложняется невозможностью ввести обычный датчик температуры во вращающуюся ампулу в процессе эксперимента. В третьих, существенным является контроль за стабильностью формы линии ЯМР. Последняя определяется стабильностью конфигурации магнитного поля в активном объеме образца и стабильностью фазы при синхронном детектировании сигнала. Особенно важно это в случае коаксиальных образцов, применяемых для измерения магнитной восприимчивости.
Указанные задачи были решены при создании экспериментальной установки для прецизионного измерения сдвигов, функциональная схема которой приведена в гл. 1У. Составными элементами установки, созданной на базе серийного свип-спектрометра с модуляцией магнитного поля, стали система автоматического отслеживания сигнала дисперсии ЯМР на основе модуляционного генератора частотной развертки, система точной термостабилизации образца по термочувствительному сигналу ЯМР лабильных протонов, а также устройство для коррекции формы линии в случае коаксиальных образцов.
В заключительных главах (У, У1) изложены результаты метрологических, модельных и реальных биофизических экспериментов, призванных продемонстрировать работоспособность предложенного метода и экспериментальной установки. Достигнутая точность измерения сдвига до ~ 0,0015 Гц при паспортной разрешающей способности спектрометра — 0,24 Гц свидетельствует о хороших потенциальных возможностях метода. При измерении магнитной восприимчивости растворов достигнута точность 3,5*10“ , что совпадает с возможностями лучших весовых установок. Исследования
- II -
геометрии активного центра растительной пероксидазы и комплексов транспортной РНК методом детектирующих зондов показали, что с помощью прецизионных измерений сдвигов даже на спектрометре среднего класса, каким является прибор 35-г/8-1 С^ГеьРа- } возможны исследования биомакромолекул при концентрациях ~ ТО-4 М. При использовании спектрометров высшего класса с большей рабочей частотой, более высокой чувствительностью и разрешающей способностью возможности метода прецизионных измерений неизбежно возрастут и позволят, в частности, уверенно работать с раство-
С
рами макромолекул, концентрация которых ^10 М.
В целом предлагаемый метод представляется относительно несложным и достаточно надежным, и с успехом может быть применен в исследовательской практике.
- 12 -
Глава I. СДВИГИ ЯМР И ИХ ФИЗИЧЕСКАЯ ПРИРОДА
В главе дается понятие сдвига сигналов ЯМР, рассмотрены единицы и системы измерения сдвигов. Обсуждаются физические основы магнитной экранировки ядер, основные типы сдвигов и виды информации, получаемые из величин сдвигов.
1.1. Понятие сдвига ЯМР. Константа экранирования.
Спектр ядерного магнитного резонанса высокого разрешения вещества, содержащего магнитные ядра ( Н , Г г Р и т.д.) представляет собой набор групп линий, разнесенных по частотной развертке спектра. Взаимное расположение линий спектра, расстояние между линиями и группами линий являются характерными для конкретного соединения. Стремление однозначно охарактеризовать спектры ЯМР привело к развитию понятия сдвига линий ЯМР /I/.
Под сдвигом в спектроскопии ЯМР понимают положение резонансной линии или группы линий относительно изолированной линии, выбранной за эталон. В протонном магнитном резонансе (ПМР) основным эталоном служит сигнал протонов тетраметилсилана, представляющий собой узкую линию, расположенную в области более низких резонансных частот (более сильного магнитного поля)/1,2/.
С целью стандартизации спектров ЯМР введены относительные единицы измерения сдвигов, так называемые миллионные дож (м.д.):
<г= - — • 106 (1.1)
х х
где $ - резонансная частота исследуемого сигнала, уэт - резо-нансная частота эталонного сигнала, $-ра£- усредненная по всевозможным химсдвигам частота, избранная в качестве рабочей. В шкале сдвигов ПМР по Тирсу сигналу тетраметилсилана присваива-
- 13 -
ют значение (• = +10 м.д. /2/.
Для изолированного магнитного одра справедливо условие резонансного перехода
и= а2)
где // - гиромагнитное отношение для данного ядра, Не - поляризующее магнитное поле (напряженность). Реально в методе ЯМР имеют дело с ядрами в составе молекул, находящихся, как правило, в конденсированном состоянии, в составе образца с конкретной геометрией. Б этом случае на ядро действует поле Нэ/рр., отличное от Но . Отличия обусловлены диамагнитной экранировкой, осуществляемой ближайшими к ядру (по отношению ко всей молекуле) электронами, в том числе участвующими в образовании химической связи с соседними атомами; электронными токами в ароматических структурах, входящих в состав данной молекулы или других молекул, взаимодействующих с данной. Отличия могут быть также связаны с присутствием в образце парамагнитных центров (ПМЦ) и, наконец, с объемным диамагнитным экранированием, осуществляемым веществом образца в целом /3/. Внешнее и действующее поля связывают соотношением
Н э<р<р, = (1~б) Не (1.3)
где 6 - т.н. константа экранирования. Константа имеет обобщенный характер и может быть как положительной, так и отрицательной. Объемное диамагнитное экранирование можно отделить от внутри- и межмолекулярных эффектов, поставив в соответствие каждому из эффектов константу экранирования, б'оЪём. и 6 молек, Константа бовк* = /и . £ , где - объемная статическая магнитная восприимчивость образца (точнее, разность восприимчивости образца и воздуха),№ - фактор размагничивания, зави-
- 14 -
сящий от геметрш образца /3/. /П = I для сферы, Ш = 2?Г/3 для цилиндра, длина которого много больше диаметра. В результате (1.3) заменяется выражением
Нэрр. = а-мхх 1- {1Л)
и обобщенная константа экранирования принимает вид
<5" = молен. + МХ>- ^молен'
/>
Поскольку <^МО/еН л' а'осУъё'Н ^ 10' , последним произведением пренебрегают /I/.
С помощью выражений (1.1 - 1.4) легко связать величины сдвигов с константами экранирования. В случае, когда эталонное вещество входит в состав образца ("внутренний эталон”),
10 (Хмолен. ЭТ ^МОЛеИ.)/(/' /Мр — (>о) (1.5)
6Мслензт~ константа молекулярного экранирования эталона, ё0 -условная константа молекулярного экранирования, соответствующая выбранной рабочей частоте . На практике достаточно точным
считается выражение /I/:
Ю * (б'молекэт, - б'молен.) (1.6)
Если эталон помещен в изолированную микроампулу ("внешний эталон"), очевидно
Г * 10 ЧКолен+Х * т>т.Х»7. - (1.7)
На практике стремятся применять эталонный и основной образцы с одинаковыми факторами размагничивания, Мэт. = М . так что
10*[(4чоленэт б'молек) *МдХ] (1.7а)
где ЛХ =Аг.-Л •
1.2. Химический сдвиг.
В понятие химического сдвига включаются все эффекты, свя-
- 15 -
зэнные с экранировкой ядер за счет диамагнитной электронной прецессии (электронных токов) в данной молекуле и в ближайшем окружении. Ограничимся, однако, рассмотрением экранировки ближайшими к ядру электронами, нслючая валентные. Описание этих эффектов позволяет выявить общие физические основы диамагнитного экранирования.
Если на атом действует внешнее магнитное поле Но , то движущийся электрон создает на ядре дополнительное магнитное поле
7г_/еь \2І _ є2 хх(Но* Ю
V' 2теСг' 4і <1-8)
- радиус-вектор электрона в координатах атомного ядра, / £ -орбитальный момент электрона. Переходя к рассмотрению электронного ансамбля в молекуле, заменяют точечный заряд электронной плотностью и интегрируют (1.8) по эффективному объему
молекулы. Такая задача решена Лэмбом /4/ для сферически симметричной плотности, когда 1-. = 0. При этом Н коллинеарно внешнему полю Но , а электронные состояния можно рассматривать как невозмущенные /5/. Формула Лэмба для константы экранирования
<*■
пригодна для расчета экранировки в атомах с заполненной оболочкой (^ -состояние).
Если электронная плотность не обладает сферической симметрией, расчет Лэмба неприменим. В гамильтониан электронов добавляется член и волновые функции электронов претер-
е 77' ТГ
певают возмущение. Наведенное поле Н уже не коллинеарно Но , и экранирование описывается тензором второго ранга о . Компоненты этого тензора получаются из (1.8), причем классические
- 16 -
величины заменяются соответствующими квантовыми, усредненными ПО возмущенным СОСТОЯНИЯМ /5/. В частности, ДЛЯ компоненты б'є2. имеем
<Ґ -і!/оШо\ М )У М>У"/4т/д) Ф1%1п)ф1Ьг1°)
и-ЗтАІ™ / Ы'£- <1-1°)
Другие компоненты тензора экранирования получаются из (I.10) формальной подстановкой соответствующих индексов. Выражение (I.10) носит название формулы Рэмзи /1,5,6/.
В ШР высокого разрешения, имеющем дело с молекулами, хаотически и быстро меняющими ориентацию, наблюдаемые химические сдвиги и соответствующие им эффективные константы экранирования определяются следом тензора экранирования 4 /7/.
Выражение (I.10) распадается на два слагаемых, называемых, в соответствии со знаком их вкладов в экранирование, диамагнитным и парамагнитным. Диамагнитное слагаемое, очевидно, совпадает с формулой Лэмба (1.9). Парамагнитный член отражает возмущения, вносимые в свободную прецессию электронов в молекуле. Диамагнитный и парамагнитный члены в формуле Рэмзи имеют полную аналогию с диамагнитным и парамагнитным членами в формуле Ван-Флека, описывающей диамагнитную восприимчивость молекулы /8/.
Формула Рэмзи не может быть применена для расчетов непосредственно, ПОСКОЛЬКУ требует знания всех возбужденных состояний. Для расчетов применяют метод средней энергии и вариационные методы, избавленные от указанного недостатка /I/. Однако формулы Лэмба и Рэмзи позволяют оценить общие физические свойства химсдвигов. Нетрудно заметить, что (1.9) и (I.10) не содержат зависимости от внешнего магнитного поля По и температуры Т , по крайней мере в явном виде. Действительно, отсутствие
- 17 -
зависимости констант экранирования от поля выполняется с хорошей точностью. Большинство наблюдаемых в опыте зависимостей константы экранирования от температуры связано с различными видами взаимодействий молекул в растворе, а также с температурным равновесием различных молекулярных конформаций и не имеют отношения к формуле Рэмзи. Петракис и Седерхольм /9/ указали, что зависимость константы экранирования от характера атомных колебаний также может приводить к температурной зависимости химсдвигов. В самом деле, константа экранирования ядра зависит от размеров молекулы: формулы (1.9) и (I.10) содержат операторы координат. При изменении характера атомных колебаний эффективные размеры молекул также изменяются. Этот эффект проявляется при изотопных замещениях ("изотопные сдвиги") /10/. С учетом возбужденных колебательных состояний температурная зависимость константы диамагнитного экранирования предстает в виде
^ Го) (-ехр (-/, Ж/кТ )
с? = ——Ч--------------------ї А— (і.п)
на5л. / + ]Г )\. еХр (- Ь /кТ)
. < где - частота колебаний на і -ом колебательном уровне, -
выроаденность этого уровня, б' константа экранирования, соответствующая і -ому колебательному уровню /1,9/.
1.3. Межспиновое взаимодействие и сдвиг.
Существуют различного рода межспиновые взаимодействия, вклад которых в оператор энергии ядерного спина описывается общим выражением — ^ _
= ії'ЇО.^ (1Л2)
где ^ - спиновый оператор частицы, вообще говоря, отличной от данного ядра со спином X (спин неспаренного электрона, спин
- Київ+380960830922