2
6
6
8
9
10
12
12
14
14
14
21
32
50
52
57
65
70
86
96
99
99
100
101
101
102
103
103
103
107
107
109
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.....................................
Актуальность темы............................
Обоснование выбора объектов исследований.....
Цель и задачи исследований...................
Научная новизна..............................
Практическая значимость работы...............
Основные положения диссертации, выносимые
на защиту....................................
ОБЗОР ЛИТЕРА ТУРЫ............................
Современное состояние производства ПЯВ и
ассоциированных вакцин.......................
Противоящурные вакцины.......................
Ассоциированные вакцины......................
Адъюванты и сорбенты.........................
Культивирование ВЯ...........................
Очистка, концентрирование и консервирование...
Инактиванты..................................
Стабильность биопрепаратов...................
Контроль качества вакцин ....................
Современные требования национального законодательства и международных стандартов к организации производства и производству
биопрепаратов................................
Заключение по обзору литературы..............
МАТЕРИАЛЫ, ОБОРУДОВАНИЕ И МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЙ.................................
Материалы....................................
Оборудование.................................
Животные.....................................
Штаммы.......................................
Вакцины......................................
Методы исследований..........................
Методы получения и контроля воды.............
Методы получения и контроля питательных сред Методы получения и контроля культур клеток....
Методы получения и контроля штаммов ВЯ.......
Определение инфекционной и комплемент связывающей активности ВЯ типов О, А, С......
3
3.6.6. Определение содержания 146 8-компонента
В Я типов 0,А,С........................................... ПО
3.6.7. Методы очистки и концентрирования ВЯ.................... 110
3.6.8. Методы оценки качества адъювантов....................... 111
3.6.9. Методы оценки качества сорбентов........................ 112
3.6.10. Методы оценки качества ПЯВ.............................. 113
3.6.10.1. Методы оценки авирулентности............................ 113
3.6.10.2. Методы оценки безвредности.............................. 115
3.6.10.3. Методы оценки иммуногенной активности................... 115
3.6.10.3.1. Определение количества иммунизирующих
(защитных) доз (ИмД50)................................... 115
3.6.10.3.2 Определение уровня противоящурных антител................ 117
3.6.10.3.3. Определение местного иммунитета......................... 117
3.6.11. Методы оценки качества ассоциированных вакцин 118
3.6.12. Экология и безопасность при ящуре....................... 119
3.6.13. Методы статистического анализа и оценки............. И9
экономической эффективности..........................
4. РЕЗУЛЬТА ТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 120
4.1. Оптимизация технологических стадий
крупномасштабного производства ВЯ.................... 120
4.1.1. Влияние физических, химических и других
факторов на качество ЭЭЯ КРС............................. 120
4.1.2. Определение влияния качества питательной среды и отдельных компонентов
на культивирование ВЯ.................................... 130
4.1.3. Входной контроль компонентов
питательных сред......................................... 138
4.1.4. Выбор схемы адаптации ВЯ к ЭЭЯ КРС.................. 156
4.1.5. Оценка качества ВЯ при хранении в нативном,
замороженном и лиофилизированном состоянии............... 165
4.1.6. Получение воды разной степени очистки............... 177
4.1.7. Получение гидролизатов белков, экстракта
дрожжей и оценка их качества............................ 183
4.1.8. Получение и контроль геля ГОА........................... 195
4.1.9. Изучение действия хлороформа, метиленхлорида,
фреона-113 и полигуанидинов на ВЯ........................ 206
4.1.10. Использование метода ультрафильтрации для
концентрирования ВЯ...................................... 213
4.1.11 Подбор эффективных инактивантов для ПЯВ
и ассоциированных вакцин................................. 219
47
растворах детергента Твин-80. По сравнению с простой эмульсией двойная эмульсия, обладая одинаковой антигенностью, менее вязкая, более удобная для введения и более стабильная; она также образует менее выраженные пролиферативные образования в месте инъекции.
Сорбированные на геле ГОА антигены можно также эмульгировать в масле и получать эффективные вакцинные препараты. Этому вопросу значительное внимание придавали Самуйлеико А.Я., Шапкина Т.А. и др. в своих работах (295, 296, 297, 379, 380). Недостатками вакцин с масляными адъювантами является высокая вязкость. Вязкость можно значительно снизить добавлением эмульгаторов, таких как Твин-80 и Твин-40. Перспективны монтаниды, применение которых значительно снижает вязкость до 250 сп и повышает стабильность (более 1 года при 4°С и более 3 мес. при 37°С). Несмотря на некоторые недостатки, масляные адъюванты благодаря значительному повышению иммуногенности вирусных вакцин представляют большой практический интерес. Имеются многочисленные работы по созданию эффективных масляных (эмульгированных) вакцин (143, 180, 276, 296, 297, 379, 380, 402, 403, 417, 425, 446, 488, 525, 540, 592, 593, 621, 648, 691). В опытах Michelson К. в 1961 г. впервые было констатировано, что экспериментальные ПЯВ в виде масляной эмульсии с такими эмульгаторами, как Спан и Твин, обладают более высокой иммуногенной активностью на свиньях, чем сорбированные препараты. В дальнейших экспериментах американских исследователей McKercher P. et al. в 1967 г. и Morgan С. et al. в 1970 г. установлено, что противояшурная моно- и поливалентная вакцина в виде водно-масляной эмульсии, изготовленная из культурального вируса типов О, А и С, инактивированного глицидальдегидом и ацетилэтиленими-ном, обеспечивает создание напряженного и продолжительного иммунитета у свиней до 6 мес. после вакцинации и 12 мес. после ревакцинации.
В нашей стране для иммунизации свиней разработана эффективная противоящурная эмульсионная вакцина из лапинизированного вируса (200). В лабораторных исследованиях испытаны вакцины, в виде водно-масляной и множественной эмульсии. Эмульсионная ПЯВ в дозе 1 мл у свиней созда-
48
ет напряженный иммунитет на 6 мес. после прививки. У КРС вакцина также обеспечивает создание напряженного иммунитета, но отмечается ее повышенная реактогенность в сравнении с сорбированной вакциной.
ПЯВ в виде множественной эмульсии из ВЯ типов Oi, А24 и Сз , размноженного в ЭЭЯ КРС или в суспензии клеток ВНК-21, испытана Riven-son A. et al. в 1982 г. в лабораторных и производственных опытах на КРС, овцах и свиньях. Вакцина при подкожном применении КРС обладала уме-ренной реактогенностью и обеспечивала создание наряженного иммунитета в течение 6 мес. после вакцинации и 12 мес. после ревакцинации.
С целью снижения вязкости водно-масляпой эмульсии Herbert А. в 1967 г. предложил технологию изготовления множественной эмульсии, основанную на том, что водно-масляная эмульсия диспергируется с равным объемом физиологического раствора с 2% эмульгатора, растворенного в воде (Твин-80). В результате получена стабильная жидкая эмульсия, обладающая меньшей реактогенностью по сравнению с водно-масляной эмульсией.
Лабораторией Роже Беллон (Франция) разработана технология изготовления противоящурной моно-, би- и трехвалентиой вакцины типов Oj, Л5 и С в виде множественной эмульсии. ВЯ, выращенный в культуре перевиваемой линии клеток почки свиньи IB-RS-2, инактивировали глицидаль-дегидом и диспергировали в равном объеме вазелинового масла в присутствии 10 %-ного масляного (арлацел А) и 2,5 %-ного водного (эмульгин) эмульгаторов. Вакцина в дозе 3 мл при внутримышечном введении создает у 70-80 % свиней напряженный иммунитет в пределах 3-6 мес.
ПЯВ в виде множественной эмульсии с водной дисперсионной средой по своей иммуногенной активности уступает препаратам, изготовленным в виде водно-масляной эмульсии. Поэтому фирмой «Сепик» (Франция) предложены новые эмульгаторы: моитанид 80, 888 и 103. При изготовлении ПЯВ на основе использования масла «маркол 52» и эмульгатора «монтанид 103» Abaracon D. et al. в 1982 г. получили относительно жидкий и стабиль-
- Киев+380960830922