Содержание
Введение 3
Обзор литературы 6
Глава 1. Исследование динамики вещества в конденсированной фазе Часть 1. Рэлсевское рассеяние мессбауэровского излучения (РРМИ)
1.1 Классификация процессов рассеяния 6
1.2 Рассеяние медленных нейтронов, синхротронного излучения, рентгеновских и 9 мессбауэровских гамма-квантов
1.3 Исследование внутренних движений конденсированного вещества методом 11 РРМИ
1.3.1 Теоретические основы РРМИ 11
1.3.2 Экспериментальное исследование динамики вещества методом РРМИ 17 Глава 2. Исследование внутримолекулярной динамики белков и их гидратации 27
2.1 Мессбауэровская абсорбционная спектроскопия 27
2.2 Дифракция рентгеновских лучей. 33
2.2.1 Мало- и среднеугловое рассеяние 34
2.3 Рассеяние нейтронов (PH) 44
2.4 Рэлесвское рассеяние мессбауэровского излучения 45
Глава 3. Аппаратура и методика измерений 56
3.1 Спектрометр РРМИ 56
Глава 4. Сравнение динамических свойств различных глобулярных белков и 61
юлиглутаминовой кислоты в состоянии а- спирали и клубка. Данные Рэлеевского эассеяния Мессбауэровского излучения
Глава 5. Изучение процесса гидратации лизоцима и миоглобина с помощью 73
Зольшсуглового рентгеновского рассеяния
Глава 6. Изучение влияния гидратации на динамику лизоцима методом 82
согерентного рэлеевского рассеяния мессбауэровског о излучения
>. 1 Структура и функция лизоцима 82
5.2 Условия эксперимента 88
5.3 Результаты измерений и их обработка 88
Зыводы ЮЗ
Іриложения 105
Дитируемая литература 124
Введение.
Изучение динамического поведения биополимеров привлекает большое внимание многих исследовательских групп, работающих в области физики и химии биологических систем. Этот інтерес связан с тем, что попытки объяснения многих элементарных процессов (фотосинтез, <аталитическая активность ферментов и т.д.) только лишь с точки зрения пространственной :труктуры и стабилизации биополимеров не привели к ясному их пониманию [1]. В настоящее фемя считается установленным, что конформационные превращения молекул биополимеров їлияют на их функциональные свойства. Так, например, согласно многим моделям [юрментагивного катализа и процесса переноса электрона функциональная активность белков іепосредственно связана с их динамическими свойствами [1-6]. Внугриппобулярная динамика іграег важную роль в функционировании даже простейших небольших по размеру белков. -Іапример, кислород должен попасть в активный центр миоглобина, который находится внутри молекулы. Однако в структуре молекулы этого белка не существует специального канала для ірохождсния кислорода. Активность миоглобина обеспечивается флуктуациониыми тепловыми івижениями атомных групп молекулы, которые обеспечивают диффундирование (дрейф) :нслорода к активному центру. Для понимания функционирования белков, важно выяснить, :акие именно группы белковой молекулы движутся и с какой амплитудой, а также времена :орреляцин их движений. Поэтому, изучение внутриглобулярной динамики является ктуальным вопросом современной биофизики. Белки функционируют в водном окружении, ода принимает активное участие в формировании нативной структуры и нативной динамики елка. Поэтому, важным является вопрос о динамике связанной с белком воды. В связи с этим едется интенсивное исследование динамики белков различными физическими методами, таких ак водородный обмен [7], метод спиновых меток [8], гамма - резонансная спектроскопия 10-13], рентгенодинамический анализ (РДА) [14, 137], рассеяние нейтронов (PH) [9, 15, 125] и .д. Прямые методы исследования флуктуаций структуры, такие как гамма - резонансная пектроскопия, метод спиновых меток, ЯМР (21, 14], люминесценция, дают, по-существу, аниые о локальных движениях в биополимерах. Методы РДА. PH, и мессбауэровской бсорбци он ной спектроскопии (МАС) позволяют не только качественно, но и количественно писывать динамические свойства биополимеров с помощью корреляционных функций Ван !ова, в которых содержится вся структурная и динамическая информация об изучаемой
3
системе [17, 18]. В метоле МАС возможно измерение энергии у-лучей с точностью до 4Е/Е-10 !\ однако, этот метод не позволяет варьировать переданный у-квантом системе импульс. В методе рентгеноструктурного анализа легко варьируется переданный импульс, но тракти чески полностью утрачивается энергетическое разрешение вследствие большой ширины эентгеновской линии по сравнению с характерными изменениями энергии рассеянных системой фотонов [19]. Метод рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения (PPM И) обладает достоинствами как MAC так и рентгеноструктурного анализа. Использование в методе ЭРМИ комбинации мессбауэровского источника и детектора позволяет обуславливает шергетическое разрешение такое же, как и в MAC. Эго на несколько порядков выше достигнутого разрешения даже для прецизионных нейтронных спектрометров (-10 6 эв), не •оворя уже о РДА (1 эв). Такое энергетическое разрешение метода позволяет регистрировать 5слковые движения с временами корреляции — КГ6 -10 9 сек по уширению линии інергетического спектра или движений с временем корреляции < 10 7 сек по уменьшению доли /пругого рассеяния. В то же время в РРМИ имеется возможность изменения угла приема досеянного излучения (переданного импульса), в том числе до сравнительно малых углов. Это юзволяет получать данные о подвижности в пределах значительно больших областях, чем в ИАС, то есть о движениях с большой амплитудой. Еще одно преимущество РРМИ перед MAC юстоит в том, что рассеивающий образец может и не содержать мессбауэровских ядер. Этот [ткт, как и то, что в РРМИ возможны измерения при более высоких температурах и степенях •идратации делает РРМИ универсальным методом исследования динамики атомов в сонденсированной фазе [19, 20|. Сравнительно долгое время результаты в РРМИ получали с іспользованием «некогерентного» варианта метода, то есть с применением мягких условий юллимации 122, 13]. Такой подход позволяет значительно увеличить набираемую статистику, а акже в этом случае значительно проще интерпретация экспериментальных данных. Не так іавно динамику белков стали изучать с помощью «когерентного» варианта метода, т.е. с іспользованием жестких условий коллимации [23,24, 25]. С помощью «когерентного» варианта іетода, в принципе, возможно определить форму м размеры движущихся сегментов в глобуле. )днако, когерентные эффекты значительно труднее для интерпретации. Еще одна іринципиальная трудность состоит в том, что белки нормально функционируют лишь в водном •кружении или в растворителе, содержащем воду. Поэтому изучение динамики белков приводит к изучению динамики двух- или трехкомпонентных систем.
4
Целью работы было изучение изменения динамических свойств водно-белковых систем при IX последовательной гидратации на примере ряда глобулярных белков - в основном, лизоцима, I также миоглобина, сывороточного альбумина человека и а-лактальбумина, установление размеров и формы движущихся групп в глобуле лизоцима, получение количественных <арактеристик внутриглобулярной динамики, межглобулярной динамики лизоцима и динамики лежбелковой воды. Также была поставлена задача сравнить динамику глобулярных белков >азных структурных типов - а и (сс+(3).
Тгрукп ри н объем работы. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, приложений и шиска цитируемой литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАЬОГЫ
?о введении обосновывается актуальность проблемы, перспективность метода РРМИ и дается формулировка основной цели работы.
$ перво»! и второй главах содержится литературный обзор методов и результатов изучения щнамики водно-белковых систем. В первой главе обсуждаются преимущества и недостатки метода РРМИ по сравнению с методами рассеяния нейтронов и рентгенодинамического шализа, а также рассеяния синхротронного излучения. Дастся краткий обзор -кснериментальных работ по исследованию динамики атомов в кристаллах и аморфных ;сщесгвах. Во второй главе дается краткий обзор работ по исследованию динамики белков. 1риведены результаты работ по мессбауэровской абсорбционной спектроскопии (МАС), щфракции рентгеновских лучей и когерентному рассеянию рэлеевского излучения.
^ тегьей главе описывается аппаратура и методика измерений неупругой интенсивности и пругойдоли РРМИ.
? четвертой главе обсуждаются полученные данные для доли упругого РРМИ на различных лобулярных белках и поли глутаминовой кислоте в состоянии а-спирали и неупорядоченного лубка.
{ пятой глине обсуждаются результаты изучения процесса гидратации лизоцима и шоглобина с помощью большеуглового рентгеновского рассеяния (БРР).
Исстан глава посвящена изучению влияния гидратации па динамику лизоцима методом огерентного рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения.
5
Обзор литературы.
Глава 1. Исследование динамики вещества в конденсированной фазе
Одним из наиболее мощных методов, применяемых в настоящее время для изучения динамики атомно-молекулярных движений в конденсированном веществе, является метод рэлеевского рассеяния мессбауэровского излучения (РРМИ). Применение его в экспериментальных исследованиях обусловлено, во-иервых, его рекордным энергетическим разрешением (*10‘д эВ), а во-вторых, относительно простым оборудованием. Впервые возможности метода были продемонстрированы в работе [28], где изучались движения в твердом теле, не содержащем мессбауэровских ядер.
Часть 1. Рэлссвскос рассеяние мессбауэровского излучения (РРМИ)
1.1. Классификация процессов рассеяния.
Процессы рассеяния элементарных частиц многоатомными системами принадлежат к числу наиболее сложных процессов в динамике многих тел. Поэтому в настоящее время не существует общего метода описания этих процессов. Однако, в некоторых предельных случаях применимы приближенные методы. Например, простейшие условия для изучения рассеяния на сложной системе создаются тогда, когда энергия связи частицы в этой системе (мишени или рассеивателе) мала по сравнению с кинетической энергией падающей элементарной частицы или характерная область взаимодействия при рассеянии много меньше дебройлевской волны частицы. Приближение, в котором кинетическая энергия налетающей частицы много больше энергии связи рассеивающей частицы в веществе, называют иногда импульсным приближением [37]. В этом случае многочастичная задача сводится к двухчастичной, т.е. к паре рассеивающая частица - налегающая частица. В амплитуду рассеяния, рассчитанную для свободной частицы, детали рассеивающей области будут давать пренебрежимо малый вклад. Однако эффекты отдачи будут вносить различный вклад в случае свободного и связанного состояний рассеивателя. В импульсном приближении время столкновения гораздо меньше, чем характерные времена движений в исследуемой мишени, что справедливо в случае нерезонансного рассеяния. Здесь время столкновения приближенно равно времени локализации падающей частицы в области взаимодействия [37,38].
Такой подход позволяет разделить процессы «нндивиду&тьного» рассеяния и «коллективной» отдачи. Поэтому для изучения подвижности атомов и молекул мишени необходимо рассматривать такие процессы рассеяния, в которых изменение энергии рассеянных частиц отражало бы динамику изучаемого вещества.
6
При исследовании методом РРМИ динамических и структурных свойств не содержащего мессбауэровских ядер вещества практический интерес представляют два процесса рассеяния: рэлсевское и комптоновское рассеяние гамма - квантов. Сечения рассеяния этих процессов
электронами атомов. Дифференциальные сечения этих процессов зависят от угла рассеяния 20, поляризации излучения и эффектов отдачи. Чтобы охарактеризовать эти процессы ниже приведем краткую классификацию видов рассеяния.
Рассеяние гамма-квантов веществом можно разделить на два основных вида: когерентное и некогерентное [201. Когерентное рассеяние зависит (по определению) от взаимного расположения в пространстве рассеивающих центров и общности их физических свойств. При этом виде рассеяния невозможно выделить центр, ответственный за акт рассеяния, что позволяет рассматривать эти центры как единый коллектив. Когерентная составляющая сечения рассеяния пропорциональна квадрату суммы амплитуд рассеяния от соответствующих центров:
-де N - число рассеивающих центров. Г| и а; - амплитуда и сечение рассеяния на I - ом
Существование тех или иных элементов беспорядка в ансамбле рассеивающих центров, склонение от общности свойств приводит к нерегулярным, случайным фазовым юотношениям между амплитудами рассеяния различных центров. Это приводит к юзникновекию некогерентной компоненты рассеяния:
-1екогерентная составляющая пропорциональна числу рассеивающих центров (ак ~ N ). Иногда можно даже, в принципе, указать, на каком центре произошло рассеяние.
Согсрентное и некогерентное рассеяние, в свою очередь, можно подразделить на упругое и (супругое рассеяние. Упругое рассеяние возникает тогда, когда рассеянная частица не (зменяет свою энергию, в противном случае рассеяние является неупругим.
Явление когерентности может возникать как при рассеянии на атоме (представляющий обой многоэлектронную систему), так и на совокупности атомов исследуемого вещества. Согерентная компонента рассеяния, возникающая при столкновении гамма-квантов с лектронами отдельного атома, приводит к появлению упругого или, так называемого.
приблизительно равны 10 24 см2 и характеризуют взаимодействие гамма-квантов с
дентре [39]. Этот вид рассеяния сопровождается интерференционными явлениями и <7к ~ 1М2.
7
рэлеевского рассеяния (без учета эффектов отдачи для всего атома - электронов и ядра) [20]. Сели рассеяние на атоме происходит некогерентным образом, то возникает неупругое, или гак называемое комптоновское рассеяние.
Когда рассеяние гамма-квантов происходит на атомах вещества, то дальнейшая классификация процессов рассеяния связана с эффектами отдачи. Если при рассеянии тамма-квантов отдачу принимает вся рассеивающая система, то могут возникать следующие виды рассеяния:
1. когерентное упругое и неупругое рэлеевское рассеяние;
2. пскогерентное упругое и неупругое рэлеевское рассеяние.
При этом когерентность упругого и неупругого рэлеевского рассеяния будет определяться степенью упорядоченности рассеивателя. Когерентное неупругое рэлеевское рассеяние связано с обменом энергией между налетающими гамма-квантами и коллективными степенями свободы конденсированного вещества. Некогерентное упругое рэлеевское рассеяние возникает, если в рассеивателе существуют элементы беспорядка в расположении атомов. Для когерентного нсулругого рассеяния выполняется закон сохранения энергии и импульса, а для некогерентного неупругого выполняется только закон сохранения энергии 39]. Это означает, что в данном акте рассеяния с фиксированным изменением энергии эасссянной частицы 6Е может принимать участие фонон (квант коллективного возбуждения з кристалле) с энергией Иу = 6Е и произвольным волновым вектором. Пскогерентное юупругое рассеяние может быть связано также и с обменом энергии между рассеянным -амма-квангом и индивидуальными степенями свободы (например, диффузионное движение помов или молекул). В этом случае энергия отдачи воспринимается отдельным атомом.
В экспериментах по РРМИ энергетический анализ рассеянных гамма-квантов юуществляется путем их пропускания через резонансный поглотитель, содержащий те же юссбауэровские ядра, что и радиоактивный источник. В итоге энергетическое разрешение без учета аппаратурного уширения линии) будет определяться естественной шириной ровня для мессбауэровских переходов. В этом случае упругое и неупругое рассеяние •мпирически определяются следующим образом [20]:
1)если изменение энергии рассеянных гамма-квантов 6Е меньше, чем ширина уровня мессбауэровского перехода Г (6Е « Г), то принимается, что рассеяние упругое;
2) квазиупругое рассеяние соответствует случаю, когда изменение энергии рассеянных гамма-квантов порядка ширины уровня (6Е - Г);
3) события, для которых 6Е » Г рассматриваются как неупругие.
8
В случае кристаллов или аморфных тел такое разделение на упругое и неупругое рассеяние является вполне хорошим приближением (если отсутствуют низкочастотные коллективные движения и диффузией можно пренебречь). При исследовании методом РРМИ вязких жидкостей наблюдается как неупругое, так и квазиупругое рассеяние, причем последнее обусловлено низкочастотным диффузионным движением. При переходе от жидкости к кристаллу квазиупругое рассеяние переходит в чисто упругое.
1.2. Рассеяние медленных нейтронов, синхротронного излучения, рентгеновских и мессбауэровских гамма-квантов.
Для изучения атомных и молекулярных движений в конденсированных средах часто используют медленные нейтроны, рентгеновское излучение и месбауэровскис гамма-кванты. Интересно сравнить возможности этих методов с учетом характера их взаимодействия с веществом. Отметим, что для интересующих нас энергий медленных нейтронов и электромагнитного излучения выполняется импульсное приближение.
Рассмотрим вначале рассеяние рентгеновских и мессбауэровских гамма-квантов. Так как рэлеевскос рассеяние гамма-квантов с энергией Е-104 эВ является потенциальным рассеянием на электронах атома, то время столкновения с ними гамма-кванта ^ порядка времени пролета через область взаимодействия ^ ~ (г-ьл)/с [17, 32, 37, 38], где X - длина волны излучения и г - размер атома. Для энергий 104 эВ время столкновения порядка 10 4 с. Таким образом, процесс рэлеевского рассеяния для таких квантов яв;іяется практически мгновенным по сравнению с характерными временами атомных движений 1г в конденсированном веществе (Хт < 10“ь с). Однако длина волны гамма-квантов с такими энергиями к сопоставима с межатомными расстояниями, что позволяет изучать структуру вещества посредством анализа дифракционной картины. Информацию о внутренней динамике вещества можно получить, анализируя энергию гамма-квантов, которые при рассеянии обменялись энергией с атомами, участвующими в определенных видах движения, т.е. исследуя неупругие ироцессг.г. Точность разделения упругой и неупругой компонент рассеяния зависит от степени монохроматичности источника излучения и энергетической разрешающей способности детектора рассеянных частиц. Начиная с этого момента эксперименты но рентгеновскому и мессбауэровскому рассеянию сильно отличаются по методу извлечения динамической информации. Энергетическое разрешение рентгеновских установок не превышает 1 эВ, что много больше характерных энергий атомных движений в веществе. В этом случае практически невозможно провести прямого энергетического анализа рассеянных рентгеновских квантов и используются косвенные
9
методы, использующие уменьшение интенсивности упругих пиков с увеличением, например, температуры исследуемого образца.
В случае рассеяния мессбауэровских квантов, энергетическое разрешение порядка 10“'* эВ, что позволяет с большой точностью непосредственно проанализировать энергетический спектр рассеянных частиц, т.е. разделить упругую и неупругую компоненты рассеяния.
Перейдем к рассмотрению процессов рассеяния нейтронов. В этом случае время столкновения 1с будет определяться временем пролета нейтронов через область взаимодействия. Время и , в течение которого нейтрон с длиной волны А,~1 А пролетает область атомных масштабов г—1 А, удовлетворяет соотношению - 1 [17], где гг -
характерное время для атомных движений ( < 10 13 с). Следовательно, и ~ КГ"' с для А~1 А.
Таким образом, основное отличие экспериментов по рассеянию гамма-квантов и нейтронов состоит в том, что нейтроны более чувствительны к особенностям динамики атомов рассеивателя, нежели высокоэнергетичесткие гамма-кванты [39]. Действительно, характерные скорости атомов в веществе порядка 105 с.м/с, характерные энергии колебательных квантов порядка КГ2 эВ, характерные расстояния 1А. Нейтроны с ?„~1 А имеют энергию -10 2 эВ и скорость У«105 см/с. Таким образом, нейтроны с длиной волны порядка межатомных расстояний обладают как раз характерными для вещества энергиями и скоростью. Для фотонов же с Л~1А энергия равна 10‘1 эВ и скорость - Ю10 см/с, т.е. они менее чувствительны к динамике атомов рассеивателя. Однако метод рассеяния рентгеновских лучей остается на сегодняшний день одним из основных методов изучения пространственного строения вещества. С помощью него можно исследовать также динамику кристаллов, хотя в этом случае возникает серьезная проблема учета фона, вносимого тепловым диффузным рассеянием и статическим беспорядком. Преимущество экспериментов по рассеянию мессбауэровских квантов состоит в том, что они ПОЗВОЛЯЮ! достичь рекордного разрешения по энергии для изучения движений не только в кристаллах, но и в вязких жидкостях, а также в аморфных структурах. В то время, как лучшее достигнутое разрешение нейтронных спектрометров ~ 10 6 эВ, мессбауэровский эксперимент
_о Л
дает 10" - 10 " эВ. К преимуществам мессбауэровских и рентгеновских спектрометров следует отнести также их практическую доступность для экспериментаторов (малые размеры, относительно небольшая стоимость).
Из сказанного выше можно сделать вывод, что эти три метода могут и должны дополнять друг друга при получении структурно - динамической информации об исследуемом веществе.
10
В последнее время большой интерес исследователей вызывает изучение структурно-динамических свойств веществ с помощью синхротронного излучения (СИ). Благодаря исключительно высокой интенсивности синхротронного излучения и развития техники его коллимации в настоящее время достигнуто энергетическое разрешение метода 10‘3..Л0'4 эВ. Ядерное резонансное рассеяние СИ позволяет разделить гармоническую динамику (диапазон миллиэлектронвольт) от специфической белковой динамики (диапазон микроэлектрон вольт и наноэлектроивольт) [130, 131]. В работе [129] была исследована специфическая белковая динамика в диапазоне наноэлектроивольт с помощью ядерного рассеяния синхротронного излучения. Получено, что до 180 К динамика определяется гармоническими колебаниями атомных групп белка. Свыше 180 К интенсивность рассеяния начинает резко надать нз-за включения специфических белковых движений.
В работе [132] изучалось уменьшение квадрупольного расщепления спектра ядерного рассеяния СИ на миоглобине и деоксимиоглобине с увеличением температуры. Причины уменьшения квадрупольного расщепления для этих двух случаев различны. В миоглобине, где координационное число комплекса железа равно 5, спиновое состояние есть Б=2. При увеличении температуры изменяется заселенность І2& ЧТО приводит к уменьшению квадрупольного расщепления. В деоксимиоглобине. где координационное число равно шести, Б=0, и поэтому температурная зависимость квадрупольного расщепления не может быть обусловлено факгором заселенности І28. С помощью рентгеновского исследования показано, что один атом молекулкислорода может занимать в теме две или больше различных позиции. Тепловое движение приводит к стохастическим движениям этого атома, что порождает флуктуации градиента электрического поля на ядре Ре. Это приводит к уменьшению расщепления в спектре ядерного рассеяния СИ от деокси.миоглобина.
1.3. Исследование внутренних движений конденсированного вещества методом РРМИ.
1.3.1. Теоретические основы РРМИ.
Под РРМИ понимают потенциальное рассеяние мессбауэровских гамма-квантов на электронах атома, когда внутреннее квантовое состояние атома до и после рассеяния не изменяется. Сечение такого упругого рассеяния квантов дается следующим выражением [40]:
сісь _ 8.67 • 10~3?
сЮ. він10/2
гт^с
1 + соб2 0 г ■> ,
----------[см"/стер], (1.1)
где 7, - атомный номер, Е - энергия гамма-квантов, то - масса электрона, 0 - угол рассеяния, с - скорость света. Если произвести оценки, то - 2-5 барн (10 21 см2). Как
11
- Киев+380960830922