Розділ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1.Вступ
Літературні дані, які базуються на реєстрації електричної активності ендотеліальних мембран від культивованих клітин демонструють неузгоджденість і є суперечливими між собою. Можливо, ці протиріччя викликані порушенням природного оточення ендотелію і усуненням дії таких факторів, як міжендотеліальні та міоендотеліальні зв?язки, механічного впливу кровотоку та ін. Навпаки, з?являється вплив культурального середовища на ендотеліальні клітини під час їх проліферації і диференціації.
Тому важливо було використати в роботі такі методи, які б усували якщо не повністю, то хоча б значною мірою вищеозначені небажані впливи. Для цьго було застосовано метод patch-clamp реєстрації електричної активності інтактного ендотелію ізольованої судини. Метод дозволяє здійснювати моніторинг мембранного потенціалу судинного ендотелію в його природному оточенні і є більш зручним і точним наближенням, які можна екстраполювати на електричні явища, що мають місце в судинному ендотелії in situ. Ще одна перевага даного методу - це відносна простота у дотриманні експериментальних умов і проведенні експерименту у порівнянні із експериментами, що проводяться на культивованому ендотелії.
Всі вищеозначені міркування стали базовими при виборі експериментальних методів.
2.2. Метод patch-clamp реєстрації
2.2.1. Загальні відомості про метод patch-clamp реєстрації
Метод patch-clamp реєстрації струму через іонні канали базується на основі утворення щільного контакту між кінчиком мікроелектроду та клітинною мембраною. Реєстрація стає можлива завдяки низькому значенню струму утічки між мембраною і кінчиком мікроелектроду. При цьому значно знижується рівень шуму. Критерієм якості контакту служить його опір - 10-100 ГОм. Коли утворюється такий контакт, вже можна реєструвати амплітуду струму і час перебування у відкритому стані поодиноких каналів від фрагменту плазматичної мембрани, що знаходиться під мікроелектродом. Дана конфігурація носить назву cell-attached. При відведенні мікроелектроду вверх можна відірвати фрагмент мембрани, що знаходиться під мікроелектродом. Якщо потім підняти мікроелектрод із розчину і відразу занурити назад, можливе таке утворення, що цитозольна сторона мембрани буде назовні у позаклітинному розчині. Така конфігурація носить назву inside-out. Вона дозволяє вивчати такі процеси як регуляція іонних каналів вторинними месенджерами та модуляцію іонних каналів.
Створюючи від?ємний тиск у мікроелектроді, можна прорвати мембрану під мікроелектродом. Тоді стає можливою реєстрація іонних струмів від цілої клітини. Така конфігурація носить назву whole-cell. При відведенні вверх мікроелектроду можливе утворення конфігурації outside-out - утворюється везикула, зовнішня сторона якої є зовнішньою стороною плазматичної мембрани. Така конфігурація дозволяє швидко проводити заміну позаклітинного розчину, що є зручним для дослідження дії гормонів і медіаторів.
Внаслідок ефективних електричних міжендотеліальних зв?язків ендотелій можна представити як електричний синцитій. Тому практично важко здійснювати фіксацію мембранного потенціалу інтактного ендотелію для дослідження інтегральних струмів. Проте, залишається можливість для дослідження поодиноких каналів у конфігурації cell-attached і моніторингу мембранного потенціалу. Дослідження мембранного потенціалу здійснюють шляхом створення компенсучого потенціалу таким чином, що загальний струм, який протікає через клітинну мембрану є нульовим. Тоді компенсуючий потенціал фактично буде відображати мембранний потенціал клітини. Такий режим реєстрації носить назву фіксації cтруму.
2.2.2. Метод перфорованого patch-clamp
В режимі whole-cell реєстрації можливо не лише досліджувати інтегральні струми через іонні канали, але і вивчати мембранний потенціал клітини. Реєстрація здійснюється в режимі фіксації струму. Проте, не завжди вдається досить ефективно проривати мембранний фрагмент під мікроелектродом за допомогою від?ємного тиску (як критерій ефективності можна вважати відношення кількості утворених гігаомних контактів із подальшим вдалим проривом мембрани до загальної кількості утворених гігаомних контактів). Для вирішення цієї задачі використовують антибіотики ністатин або амфотерицин, які вбудовуються в плазматичну мембрану і здійснюють перенос моновалентних катіонів через мембрану. Реально конфігурація формується протягом декількох хвилин і спостерігається як поява струму в режимі фіксації потенціалу. Далі необхідно перейти в режим фіксації струму для вимірювання мембранного потенціалу.
2.3.Описання установки для patch-clamp реєстрації
Для дослідження мембранного потенціалу і поодиноких каналів інтактного судинного ендотелію ми застосовували стандартну установку для patch-clamp реєстрації. Вона складалася із наступних частин (Рис.2.1):
Рис.2.1. Схематичне зображення експериментальної установки.
* підсилювач;
* позиціонер-маніпулятор;
* реєструюча система;
* стимулятор;
* Робоча камера.
Ми використовували стандартний підсилювач "Регистратор одиночных каналов РОК-3М", який складався із виносної головки і блоку підсилення. Динамічний діапазон підсилювача "РОК-3М" дозволяє реєструвати інтегральні струми від клітини в конфігурації whole-cell і роботу поодиноких каналів в режимі фіксації потенціалу і мембранний потенціал в режимі фіксації струму. Виносна головка кріпиться на одному із двох мікроманіпуляторів позиціонера-мікроманіпулятора ПМ-1. Вона здійснює попереднє підсилення електричного сигналу, що відводиться від мембрани і передає електричний стимул на мембрану. Головка містить вхідний роз?єм стандарту BNS, до якого кріпиться тримач для мікропіпетки. Тримач має стандартну конструкцію і розрахований на скляні мікроелектроди зовнішнім діаметром 1,5-2 м