РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкт дослідження
Об'єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів. Для отримання клітин печінки були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г, що утримувались на стандартному раціоні віварію.
2.2.Виділення гепатоцитів
Виділення гепатоцитів проводили за методом Сеглена [4] з деякими модифікаціями. Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг) та вводили гепарин (100 од.) у хвостову вену. Далі здійснювали перфузію ізольованої печінки через нижню порожнисту вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса (7-10 хв), що містив 9 ммоль/л HEPES і 0,5 ммоль/л EGTA, після чого продовжували перфузію 0,05 % розчином колагенази (тип 1А, "Sigma", США) в розчині Хенкса з 9 ммоль/л HEPES і 5 ммоль/л CaCl2 (рН 7,4; 37оС) на протязі 20 -25 хв.
Печінку переносили в середовище RPMI 1640, що містило 15 ммоль/л HEPES, пеніцилін (100 од/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл) та 5 % сироватку великої рогатої худоби, інактивовану при 56оС. Капсулу печінки розривали, клітини розділяли за допомогою диференційного центрифугування, осаджуючи паренхіматозні клітини двічі на протязі 30 сек при 280 g. Додатково гепатоцити очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини перколу (73%, 57%, 30%) на протязі 30 хв при 750 g (20оС). Очищені гепатоцити збирали на межі розділу між 73 % і 57 % розчином перколу. Гепатоцити відмивали від перколу за допомогою центрифугування в середовищі виділення та ресуспендували в середовищі культивування - RPMI 1640 з 15 ммоль/л HEPES, інсуліном (10-6 моль/л), пеніциліном (100 од/мл), стрептоміцином (100 мкг/мл) та з 10 % ембріональної телячої сироватки.
2.3.Культивування клітин та схема експерименту
Культивування клітин проводили в оброблених колагеном 24 - лункових планшетах для культур клітин ("Sigma", США) в поживному середовищі RPMI 1640 з 15 ммоль/л HEPES, 10 % ембріональної телячої сироватки та антибіотиками. Густина клітин становила - 1?105 гепатоцитів на лунку. Через 3 год після посадки неприкріплені гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Після 18 год культивування при 37оС у вологій камері з 5 % СО2 клітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки і інсуліну та продовжували культивування клітин за різних експериментальних умов протягом різних проміжків часу. Нордигідрогуаяретову кислоту (НДГК, "Sigma", США) та кофейну кислоту (КК, "Sigma", США) - блокатори ліпоксигенази додавали до кінцевої концентраціі 10-6 та 2?10-5 моль/л. Лейкотриєни В4 або С4 ("Sigma", США) вносили в культуральне середовище до кінцевої концентрації в діапазоні від
10-7 - 10-12 моль/л. З метою вивчення впливу лейкотриєнів на гепатоцити у присутності блокаторів ліпоксигеназ в культуральне середовище вносили лейкотриєни В4 та С4 в дозах 10-8 моль/л та 10-12 моль/л через 15 хв після додавання блокаторів (у концентрації 2?10-5моль). Оцінювали активність аланінамінотрансферази та електрон-транспортного ланцюга мітохондрій через 30 хв, 1 год, 4 та 24 год культивування після впливів. Вплив екзогенних ЛТ В4 та С4 (10-8моль/л) на ультраструктуру гепатоцитів досліджували через 1 та 24 год після впливів. Зміни ультраструктури гепатоцитів при дії НДКГ та КК (2?10-5моль) вивчали через 4 та 24 год після впливів.
2.4.Морфологічна оцінка культивованих гепатоцитів
Після процесу виділення клітин з печінки проводили морфологічну оцінку кількості живих клітин методом виключення барвника - трипанового синього (0,2% розчин на 0,9% NaCl) [5]. Підрахунок проводили в камері Горяєва. Ступінь очищення гепатоцитів оцінювали за морфологічними ознаками. Морфологічну оцінку клітин проводили за допомогою світлової мікроскопії (SK-14, Польща) з використанням імерсійного об'єктиву (х 100) на фіксованих ізопропанолом препаратах, забарвлених азур-еозином за Романовським.
2.5.Визначення активності аланінамінотрансферази в культуральному середовищі
Активність аланінамінотрансферази (АЛТ) в культуральному середовищі визначали колориметричним методом [6] в мікромодифікації. Метод базується на здатності ферменту в результаті реакції переамінування між аланіном та ?-кетоглутаровою кислотою утворювати піровиноградну кислоту, яка з
2,4-динітрофенілгидразином дає гідразон, що має коричневе забарвлення у лужному середовищі. Інтенсивність забарвлення пропорційна концентрації утвореної піровиноградної кислоти.
В кожну лунку 96-лункового планшета вносили 20 мкл культурального середовища. Планшет і субстрат (2 ммоль/л ?-кетоглютарової кислоти та 200 ммоль/л аланіна, у 0,1 моль/л фосфатному буфері, рН 7,4) прогрівали при 37оС для вирівнюваняя температури (10-15 хв). В кожну лунку вносили 50 мкл субстрату та інкубували 30 хв при 37о С. Після цього вносили 50 мкл 1 ммоль/л розчину 2,4-динітрофенілгидразину в однонормальній НС1. Після 20 хв інкубації при кімнатній температурі додавали 100 мкл двонормального NaОН, розчин перемішували. Через 20 хв вимірювали оптичну густину проб за допомогою рідера для мікроплашок (ЕІА Microplate Reader, "Sigma", США) при довжині хвилі 492 нм проти диференційного фільтра 630 нм. Контроль - середовище культивування з лунки, де не було клітин.
Розрахунок активності ферменту проводили з врахуванням екстинції стандартного розчину пірувату (100 мг/л) при кожному вимірюванні. Активність АЛТ виражали у мкмоль пірувату/год?105 гепатоцитів.
2.6.Визначення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій
Активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій (ЕТЛ) визначали за допомогою МТТ-тесту [108]. Принцип методу полягає в тому, що процес переносу електронів через електрон-транспортний ланцюг мітохондрій супроводжується відновленням доданого до клітинної суспензії розчинного МТТ (3-(4,5-dimethylthiazol-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) в нерозчинну форму - формазан. Кількість утвореного формазану пропорційна активності ЕТЛ мітохондрій. В подальшому формазан розчиняли в ізопропанолі з 5 % мурашиною кислотою