розділ 2
Матеріали та методи дослідження
2.1. Матеріали дослідження
Культура клітин
Перевивна культура клітин В95-8, яка входить до Каталогу Європейської колекції
культур клітин тварин [59], є В-лімфоцитами периферичної крові мавп-мармазеток,
що трансформовані ВЕБ і хронічно продукують його. Лінія клітин В95-8 одержана з
банку клітинних культур Інституту вірусології РАМН.
Сироватки крові людей, які містили або не містили антитіла до ВЕБ
При конструюванні та апробації тест-системи використовували сироватки крові як
здорових людей, так і осіб з різними захворюваннями, етіологічним агентом яких
є ВЕБ, а саме:
- сироватки донорів, які не містили HBs-антигену та антитіл до ВІЛ, одержані зі
Станції переливання крові м. Києва ( 372 зразка);
- сироватки крові здорового населення, одержані з вірусологічної лабораторії
КМТМО “Санепідемслужба” м. Києва (540 зразків);
- сироватки крові хворих на інфекційний мононуклеоз з відділення ускладнених
форм грипу, ГРВІ і нейроінфекцій Інституту епідеміології і інфекційних хвороб
АМНУ, Сімферопольської дитячої інфекційної лікарні, Київська міська дитяча
лікарня інфекційних захворювань (всього 928 зразків);
- сироватки хворих на лімфому Беркітта тестовані в референс-лабораторії СНІД
Інституту епідеміології і інфекційних хвороб АМНУ (20 зразків), вони були
попередньо тестовані в тест-системі “Platelia EBV EBNA IgG” і входили до складу
панелі сироваток ВІЛ-інфікованих з лімфомою Беркітта;
- сироватки хворих на туберкульоз (176 зразків);
- 45 серій “Імуноглобуліну людини нормального”, одержані з ДКПВБП “Біофарма”.
Всього досліджено 1 542 сироваток дорослих та 474 сироватки дітей.
Використані планшети та буферні розчин.
При підборі твердрофазних носіїв нами були досліджені планшети кількох фірм
виробників: «Медбіополімер» (Росія), «Labsystems» (Фінляндія), «Sarstedt»
(США), «Labstar» (Швеція), «Dynatech» (Німеччина), «Nunc poly sorp» (Данія).
При підборі розчинників для іммобілізації антигену на планшетах були досліджені
такі буферні розчини: 0.05 М карбонатний буфер рН 9.6; 0.01 М натрій-фосфатний
буфер рН 7.4; який містить 0.1 М NaCl; 0.05 М трис-НСl рН 7.2, який містить 0.1
М NaCl; 0.15 М NaCl pH 6.8.
Кон’югати та субстрат
Під час конструювання тест-системи використовували такі антивидові кон’югати,
мічені пероксидазою хрону:
антитіла кози проти імуноглобулінів людини класу М фірми "Sigma" (США) в
робочому розведенні 1:18.000;
антитіла кози проти імуноглобулінів людини класу G фірми "Sigma" (США) в
робочому розведенні 1:15.000;
антитіла кози проти імуноглобулінів кроля класу G фірми "Sigma" (США), в
робочому розведенні 1:1.000.
Як проявник використовували ортофенілендіамін (ОФД) «Serva» (Німеччина) в
концентрації 4 мкг ОФД в 10 мл 50мМ цитратного буферу рН 5,0 з додаванням 6 мкл
30 % перекису водню (розрахунок на один планшет).
Стандартні тест-системи.
При проведенні досліджень використовували комерційні тест-системи “Platelia EBV
EBNA IgG” (Sanofi diagnostics Pasteur, France), “Platelia EBV EA IgG” (Sanofi
diagnostics Pasteur, France) i “SIATM Epstein-Barr EBNA IgG” (Sigma
diagnostics, USA) для визначення антитіл до ВЕБ в сироватках крові та такі
тест-системи фірми “Novum diagnostica” (Німеччина): “Herpes simplex virus type
1 (HSV1) IgG ELISA”, “Varicella zoster virus (VZV) IgG ELISA” та
“Cytomegalovirus (CMV) IgG ELISA”, “Epstein-Barr virus (VCA EBV) IgG ELISA”,
призначені для виявлення в сироватках крові людей антитіл до вірусу герпесу
звичайного 1-го типу, вірусу оперізуючого лишаю, цитомегаловірусу, вірусу
Епштейна-Барр відповідно. Імуноферментний аналіз в цих випадках та облік
результатів проводили згідно інструкції виробника.
2.2. Методи досліджень
При виконанні даної роботи були використані такі методи:
вірусологічні - культивування пермісивної до ВЕБ культури клітин, нагромадження
ВЕБ в культурі;
біохімічні - одержання ВЕБ та методи його очистки, аналіз білків вірусу
Епштейна-Барр методом електрофорезу в поліакриламідному гелі;
імунологічні - одержання гіперімунних сироваток, визначення антитіл до ВЕБ,
проведення імуноферментного аналізу та імуноблотингу;
статистичні методи.
2.2.1.Культивування лімфобластоїдних культур клітин
Пересів культур клітин проводили що 3 доби. Ростове середовище для клітин В95-8
містить 90 % середовища RPMI 1640 ("Sigma" (США)), 10 % ембріональної сироватки
теляти (Gibco), пеніцилін (100 МЕ/мл), стрептоміцин (100 мкг/мл), L-глютамін
(2мМ). Клітини В95-8 вирощували в пластикових культуральних флаконах (105-106
клітин/мл) при 37 0С в термостаті в атмосфері 5 % СО2. Індуктором ВЕБ в
культурі клітин В95-8 був ТФА (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) ("Sigma"
(США)), додавання якого проводили згідно до інструкції виробника [25, 40].
2.2.2.Одержання антигенів ВЕБ із лізатів клітин В95-8
Іншим підходом для одержання антигенів ВЕБ було виділення їх з лімфобластоїдних
клітин В 95-8, які його продукують. Це питання на сьогодні є предметом
патентування. Загалом даний підхід включав в себе осадження клітин
низькошвидкісним центрифугуванням з послідуючим руйнуванням клітин в
гомогенізаторі скло-тефлон та ультразвуковим впливом. Видаляючи
центрифугуванням зруйновані клітинні стінки, надалі для конструювання
тест-системи використовували надосадову рідину, яка містила комплекс білків
вірусу Епштейна-Барр.
2.2.3. Одержання очищених препаратів ВЕБ
Вірус Епштейна-Барр очищали з 6 л культуральної рідини лімфобластоїдних клітин
В95-8. Концентрацію клітин в культурі доводили до щільності 106 клітин/мл
суспензії. Додавали в суспензію ТФА та витримували культуру ще 10 днів для
максимального виходу вірусу із клітин. ТФА під